男性不育患者精液活性氧和精漿超氧化物岐化酶活性測定的臨床價值研究

譚雪蓮，黃永漢，李穎嫦，李子萍，姜朝新，游永強，莊錫偉，龔道元

(1、佛山市南海區(qū)第三人民醫(yī)院，廣東 佛山 528244；2、佛山市第一人民醫(yī)院；3、佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院；4、佛山官窯南海經(jīng)濟開發(fā)區(qū)人民醫(yī)院官窯分院；5、佛山市禪城區(qū)中心醫(yī)院)

男性不育患者精液活性氧和精漿超氧化物岐化酶活性測定的臨床價值研究

譚雪蓮1，黃永漢2，李穎嫦2，李子萍3，姜朝新1，游永強4，莊錫偉5，龔道元3

(1、佛山市南海區(qū)第三人民醫(yī)院，廣東 佛山 528244；2、佛山市第一人民醫(yī)院；3、佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院；4、佛山官窯南海經(jīng)濟開發(fā)區(qū)人民醫(yī)院官窯分院；5、佛山市禪城區(qū)中心醫(yī)院)

目的探討精液ROS、精漿SOD測定在男性不育患者中臨床價值。方法選擇有生育力的男性健康對照組50例，男性不育癥組265例，化學(xué)發(fā)光法測定精液ROS，黃嘌呤氧化酶法測定精漿SOD活性。結(jié)果男性不育組、精索靜脈曲張組和白細胞精子癥組：精液ROS均明顯高于對照組精液ROS，精漿SOD均明顯低于對照組精漿SOD，以上組間結(jié)果差異都具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。各弱精子癥組：精液ROS均明顯高于對照組(P＜0.01)，精漿SOD均明顯低于對照組(P＜0.01)。各弱精子癥組隨著精子活力降低：精液ROS依次升高(組間結(jié)果差異有顯著性意義，P＜0.01)；精漿SOD依次降低，其中中度弱精子癥組精漿SOD與輕度弱精子癥組相比較，結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，重度弱精子癥組精漿SOD明顯低于中度弱精子癥組和輕度弱精子癥組，組間結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論ROS是影響男性不育的一個重要病因和病理因素，男性不育患者精液ROS和精漿SOD檢測具有重要的臨床意義。

男性不育；精液；活性氧；超氧化物岐化酶

氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生的活性氧 (reactive oxygen species,ROS)在生殖及發(fā)育中的損傷作用越來越受到關(guān)注，ROS也稱氧自由基,是一些具有比氧更活躍的化學(xué)反應(yīng)性的氧代謝產(chǎn)物及其衍生的含氧物質(zhì)[1]，研究發(fā)現(xiàn)精液高水平ROS是導(dǎo)致男性不育的重要原因[2]。超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)是機體內(nèi)起主要作用的酶類抗氧化劑，具有清除ROS等氧自由基，保護細胞膜免受損傷，抵抗ROS對精子的毒性作用[3]。本研究通過測定男性不育患者精液中的ROS和精漿中SOD水平，探討ROS和SOD在男性不育癥中的作用及它們間相互關(guān)系，從多角度為臨床對男性不育的診斷提供分子水平的實驗證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗對象與分組

1.1.1 實驗對象 男性不育癥組均來自佛山市禪城區(qū)中心醫(yī)院男性科不育門診就診的男性不育癥患者，年齡 22～36 歲，平均(27.0±4.5)歲，婚后性生活正常，未避孕2年以上不育，無外傷及遺傳性疾病家族史，無性功能障礙病史，體檢未發(fā)現(xiàn)有明顯睪丸、附睪及輸精管異常，女方生育能力經(jīng)檢驗排除異常。健康對照組來自有子女的自愿獻精者，年齡24～38 歲，平均 (27.5±4.7)歲。

1.1.2 實驗分組 ①健康對照組50例：精子密度≥20×109/L，精子活率＞60%,a 級精子＞25%或(a+b)級精子＞50%，精子正常形態(tài)率大于30%，有生育史；②參數(shù)正常男性不育組21例：指精子密度、活率、活力、形態(tài)等常規(guī)參數(shù)指標(biāo)全部正常；③參數(shù)異常男性不育組79例：主要指精子密度、活率、活力、形態(tài)等常規(guī)參數(shù)指標(biāo)中一個或幾個不正常；④精索靜脈曲張組25例：B超明確診斷為一側(cè)VC；⑤白細胞精子癥組52例：精液中白細胞﹥1.0×106/ml；⑥輕度弱精子癥組 27例：30%≤(a＋b)級精子＜50%；⑦中度弱精子組42例：10%≤(a＋b)級精子＜30%；⑧重度弱精子癥組19例：(a＋b)級精子＜10%。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 儀器 WLJY-9000型偉力彩色精子質(zhì)量分析系統(tǒng)(南昌新長征醫(yī)療科技發(fā)展有限公司)。

1.2.2 試劑 魯米諾和VI型辣根過氧化物酶均購自為Sigma；SOD測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 精液標(biāo)本采集與處理 ①精液標(biāo)本采集：所選受試者禁欲2～7d，于醫(yī)院處置室內(nèi)手淫取精，置干燥無菌量杯內(nèi)，37℃水浴箱內(nèi)液化，并記錄液化時間。②精漿標(biāo)本制備：精液以3000 r/min離心15 min,取上層精漿于-40℃保存待測。

1.3.2 精子密度、活率、活力等指標(biāo)測定 采用國產(chǎn)WLJY-9000型偉力彩色精子質(zhì)量分析系統(tǒng)測定精子密度、活率、活力等指標(biāo)。

1.3.3 精子形態(tài)檢查 精液涂片用改良巴氏染色，根據(jù)WHO手冊進行檢查。

1.3.4 精液ROS測定 參考“趙洪鑫等介紹測定方法[4]。用化學(xué)發(fā)光法檢測精液ROS水平，將400μl完全液化后的精液加入一次性照度計容器內(nèi)，取4μl魯米諾儲存液，同時加入8μl辣根過氧化物酶(12.4 U的Ⅵ型辣根過氧化物酶,310U/mg)。 使用Berthold照度計檢測化學(xué)發(fā)光信號約5 min,直至其達到穩(wěn)定。為了平衡精子密度對各組ROS水平帶來的混雜作用,按照下式計算調(diào)整各組ROS水平:平衡精子密度后的ROS水平=相對化學(xué)發(fā)光強度(RLU/s)×20 ×106/精子密度(精子數(shù)/ml)×0.4ml，計算后的ROS單位為RLU/s每20×106精子。

1.3.5 精漿SOD測定 按說明書操作。

1.3.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 10.0軟件包，檢測數(shù)據(jù)以±s表示，均值比較采用t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 男性不育組與健康對照組精液ROS、精漿SOD結(jié)果比較 表1結(jié)果顯示，參數(shù)正常和參數(shù)異常男性不育組精液ROS均明顯高于健康對照組，結(jié)果差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，參數(shù)異常男性不育組精液ROS高明顯于參數(shù)正常男性不育組，結(jié)果差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；參數(shù)正常和參數(shù)異常男性不育組精漿SOD明顯低于健康對照組，結(jié)果差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，參數(shù)異常男性不育組精漿SOD低于參數(shù)正常男性不育組，結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P﹥0.05)。

2.2 精索靜脈曲張組、白細胞精子癥組與健康對照組精液ROS、精漿SOD結(jié)果比較 表2結(jié)果顯示，兩組精液ROS明顯高于健康對照組(P＜0.01)；白細胞精子癥組精液ROS明顯高于精索靜脈曲張組(P＜0.01)。兩組精漿SOD明顯低于健康對照組(P＜0.01)；白細胞精子癥組精漿SOD明顯低于精索靜脈曲張組(P＜0.01)。

2.3 各弱精子癥組和健康對照組精液ROS、精漿SOD結(jié)果比較 表3結(jié)果顯示，各弱精子癥組精液ROS均明顯高于健康對照組(P＜0.01)；弱精子癥各組精漿SOD均明顯低于健康對照組(P＜0.01)。各弱精子癥組隨著精子活力降低，精液ROS依次升高，組間結(jié)果差異有顯著性意義(P＜0.01)；弱精子癥各組隨著精子活力降低，精漿SOD依次降低，其中中度弱精子癥組精漿SOD與輕度弱精子癥組相比較，結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，重度弱精子癥組精漿SOD明顯低于中度弱精子癥組和輕度弱精子癥組，組間結(jié)果差異有顯著性意義(P＜0.01)。

3 討論

表1 男性不育組與健康對照組ROS、SOD結(jié)果比較(±s)

表1 男性不育組與健康對照組ROS、SOD結(jié)果比較(±s)

注:★與健康對照組比較，P＜0.01；▲與參數(shù)正常男性不育組比較，P＜0.01；▼與參數(shù)正常男性不育組比較，P＞0.05。

患者組別 例數(shù) 精液ROS(RLU/s) 精漿SOD(nU/ml)健康對照組參數(shù)正常男性不育組參數(shù)異常男性不育組50 21 79 17.6±2.84 39.28±3.57★79.77±4.32★▲56.40±10.12 31.07±9.91★24.72±8.75★▼

表2 精索靜脈曲張組、白細胞精子癥組與健康對照組ROS、SOD結(jié)果比較(±s)

表2 精索靜脈曲張組、白細胞精子癥組與健康對照組ROS、SOD結(jié)果比較(±s)

注:★與健康對照組比較，P＜0.01；▲與精索靜脈曲張組比較，P＜0.01。

患者組別 例數(shù) 精液ROS(RLU/s) 精漿SOD(nU/ml)健康對照組精索靜脈曲張組白細胞精子癥組50 25 52 17.16±2.84 235.34±5.14★813.52±10.64★▲56.40±10.12 31.23±8.13★19.85±7.75★▲

表3 弱精子癥各組和健康對照組ROS、SOD結(jié)果比較(±s)

表3 弱精子癥各組和健康對照組ROS、SOD結(jié)果比較(±s)

注：★與健康對照組比較，P＜0.01；▲與輕度弱精子癥組比較，P＜0.01，●與輕度弱精子癥組比較，P＞0.05；▼與中度弱精子癥組比較，P＜0.01。

患者組別 例數(shù) 精液ROS(RLU/s) 精漿SOD(nU/ml)健康對照組輕度弱精子癥組中度弱精子癥組重度弱精子癥組50 27 42 19 17.16±2.84 35.21±3.93★67.77±5.61★▲98.43±6.63★▲▼56.40±10.12 34.34±9.65★27.889±8.49★●14.49±7.65★▲▼

機體內(nèi)存在抗氧化防御系統(tǒng)，SOD在男性生殖系統(tǒng)中是起主要抗氧化作用的酶類抗氧化劑[5]，具有清除ROS和中和ROS對精子的潛在毒性作用，使ROS產(chǎn)生和清除保持動態(tài)平衡，這種平衡是保持正常生育能力的基礎(chǔ)。當(dāng)機體ROS產(chǎn)生增加或SOD含量降低則打破這種平衡，產(chǎn)生精子氧化應(yīng)激損傷，可以導(dǎo)致男性不育[6]。本研究結(jié)果顯示,男性不育組精液ROS活性明顯高于健康對照組，精漿SOD活性明顯低于健康對照組，提示精液ROS活性和精漿SOD活性測定對男性不育的診斷具有重要臨床價值，另外，本研究還發(fā)現(xiàn)參數(shù)異常男性不育組精液ROS活性明顯高于參數(shù)正常男性不育組，而參數(shù)正常男性不育組精漿SOD低于于參數(shù)正常男性不育組，但結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義，這具有重要意義，說明ROS除影響常規(guī)精液參數(shù)外，還可通過其他機制導(dǎo)致男性不育，ROS有可能作為一個獨立的指標(biāo)指導(dǎo)男性不育的診斷，同時提示精液ROS活性測定比精漿SOD測定更有價值，更加準(zhǔn)確反映精子氧化應(yīng)急狀態(tài)。

Ozdamar等研究發(fā)現(xiàn)[7]，精索靜脈曲張時睪丸局部缺氧、代謝性酸中毒、無氧酵解增強，ATP被分解為次黃嘌呤，并在黃嘌呤氧化酶作用下產(chǎn)生大量的ROS，而大量ROS也會消耗過多的ROS，本研究結(jié)果證實如此。因此，ROS過多和/或者SOD過低，可導(dǎo)致氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激可能是引起精索靜脈曲張患者不育的一個重要因素[8]。研究證明，精液中的白細胞含量增加是導(dǎo)致ROS增高的重要原因之一[9]，本研究中白細胞精子癥組精液中ROS水平明顯高于健康對照組和靜脈曲張組，精漿中SOD水平明顯低于健康對照組和靜脈曲張組，推測一方面是由于白細胞本身大量產(chǎn)生ROS，另一方面則與白細胞抑制ROS清除酶如SOD、谷光甘肽等有關(guān)。

在男性生殖道中,適量低濃度的ROS對精子有著重要的生理作用，如精子的高活躍性運動、獲能及完成頂體反應(yīng)等，但是過多ROS或SOD下降可引起氧化應(yīng)急，導(dǎo)致精子運動能力下降甚至喪失，本研究結(jié)果也證實了這點，各弱精子癥組精液中ROS的水平明顯高于健康對照組，精漿中SOD的水平明顯低于健康對照組，隨著精子活動力下降，精液中ROS的水平也依次升高，精漿中SOD的水平也依次降低，最終結(jié)果導(dǎo)致ROS含量過多，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，使精子活動力下降。 ROS過多導(dǎo)致精子運動力下降的機制主要有：(1)過多的ROS引起精子細胞膜脂質(zhì)的過氧化及鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[10]，產(chǎn)生過多MAD，造成精子膜硬度增加，膜流動性減弱，使精子膜的超微結(jié)構(gòu)損傷，精子運動能力下降甚至喪失；(2)精子線粒體是提供精子運動的源泉，過多的ROS也會導(dǎo)致精子線粒體的超微結(jié)構(gòu)損傷，影響到精子運動能力；(3)ROS也會引起ATP耗竭，從而導(dǎo)致精子精子活動力喪失。

ROS是影響男性不育的一個重要病因和病理因素，男性生殖系統(tǒng)中產(chǎn)生的ROS和抗氧化劑(主要是SOD)動態(tài)平衡是保持正常生育能力的基礎(chǔ)，對男性不育患者精液ROS和精漿SOD進行檢測具有重要的臨床意義。

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Clinical significance of semen reactive oxygen species and seminal plasma superoxide dismutase activity detection in infertile patients.

TAN Xuelian,HUANG Yonghan,LI Yingchang,et al.Third People's Hospital of Foshan City Nanhai District，Guangdong Foshan 528244,China

ObjectiveTo investigate the clinical significance of semen ROS and seminal plasma SOD activity in male infertility.MethodsSemen ROS and seminal plasma SOD of 50 cases from fertile male as the healthy control group and 265 patients with male infertility as the test group were detected by chemiluminescence method and xanthine oxidase method respectively.ResultsThe levels of semen ROS and seminal plasma SOD in male infertility group，varicocele group and leukocytospermia group were significantly different from that of the healthy control group(P<0.01).The levels of semen ROS in each asthenospermia group were significantly higher than that of the healthy control group(P<0.01)and the levels of seminal plasma SOD in each asthenospermia group were significantly lower than the control group(P<0.01).The levels of semen ROS in each asthenospermia group increased(P<0.01)and the level of seminal plasma SOD decrease with the decreased sperm motility.There was no statistical significance(P>0.05)between the levels of seminal plasma SOD in moderate asthenospermia group and slight asthenospermia group.The levels of seminal plasma SOD in severe asthenospermia group was significantly lower than that of moderate asthenospermia group and mild asthenospermia group(P<0.01).ConclusionROS is an important etiological and pathological factor in male infertility.The levels of sperm ROS and seminal plasma SOD have important clinical significance.

Male infertility； Semen； Reactive oxygen species； Superoxide

R446.19，R698+.2

A

1674-1129(2012)05-0422-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2012.05.002

廣東省自然科學(xué)基金課題(No.9152902001000017)

譚雪蓮，女，1971年3月出生，畢業(yè)于佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，主管檢驗技師，醫(yī)學(xué)檢驗專業(yè)，

龔道元，男，1964年7月1日出生，副教授。