檢測PML/RARα基因的雙重熒光定量PCR方法的建立

江梅,萬臘根,簡正偉,石淙,張長林

(南昌大學第一附屬醫院檢驗科，江西 南昌330006)

檢測PML/RARα基因的雙重熒光定量PCR方法的建立

江梅,萬臘根,簡正偉,石淙,張長林

(南昌大學第一附屬醫院檢驗科，江西 南昌330006)

目的建立在一個反應體系中同時檢測融合基因PML/RARα和內參基因ABL的雙重熒光定量PCR方法。方法從DNA聚合酶含量、Mg2+濃度和引物濃度等方面進行優化，建立檢測PML/RARα和ABL基因雙重熒光定量PCR體系，從分析靈敏度，批內、批間精密度以及檢測臨床樣本陽性率等方面對雙重熒光定量PCR反應體系進行性能評價，并同時和北京思爾成公司熒光定量PCR試劑盒進行比較，分析兩者的一致性。結果成功構建雙重熒光定量PCR反應體系，檢測質粒靈敏度為103copies/ml，檢測NB4細胞的靈敏度為10-3，反應體系批內、批間精密度Ct值的變異系數CV都小于5%，檢測20例確診為APL病人，其檢測陽性率，和北京思爾成公司的PCR反應試劑一致。結論成功開發出穩定的雙重熒光定量PCR試劑盒，其操作簡單，成本低，誤差小，能夠有效地用于APL分子生物學分型診斷、用藥指導、預后觀察及MRD監測。

熒光定量PCR；PML/RARα；ABL；急性早幼粒細胞白血病

急性早幼粒細胞白血病 (acute promyelocytic leukemia，APL)是較為常見的急性髓細胞白血病(acute myeloid leukemia，AML) 的一種特殊類型[1]。研究表明，98%以上的APL病人出現非隨機的染色體易位 t(15；17)(q22；q21)，造成 PML、RARa 基因重排而形成PML/RARα融合基因[2]，該融合基因在APL白血病的發生中起關鍵作用，同時也成為APL特異性的分子標志。因此對APL病人PML/RARα融合基因的檢測成為APL分子生物學分型診斷、用藥指導、預后觀察及微小殘留病 (minimal residual disease，MRD)診斷的重要技術手段[3]。 臨床上檢測PML/RARα融合基因的方法很多，最常用的是熒光定量RT-PCR，為了實現操作簡單，成本低，誤差小，本研究擬在已有的工作基礎上，建立在一個反應體系中同時檢測PML/RARα和ABL的雙重熒光定量PCR方法，該方法在一個反應體系中檢測兩個基因，這樣可以減少試劑用量，同時減少操作步驟，大大減少實驗成本和實驗時間。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料 RPMI-1640培養基、D-Hanks、FBS購于 Hyclone公司、Trizol、DNA Marker為天根公司產品、RT試劑盒、RNA酶抑制劑為TaKaRa公司產品、實時熒光定量PCR試劑盒購于北京思爾成生物技術有限公司、Tap DNA Polymerase購自Fermentas公司、dNTP和人淋巴細胞分離液購自Solarbio公司、E.coli DH5α 和質粒 PCMV4-PML/RARα-ABL為本室自藏。NB4細胞由上海交通大學血液學研究所惠贈。

1.1.2 主要儀器 電泳儀、凝膠成像儀購自北京君意東方電泳設備有限公司、湘儀H-1850R臺式高速冷凍離心機購自上海科學器材有限公司、細胞培養箱為TherMo、熒光定量PCR儀ABI7300購于美國ABI公司、紫外分光光度儀購自BIO-RAD公司。

1.1.3 臨床病例 以FAB分型為基礎診斷的急性早幼粒細胞白血病初治患者4名,化療形態學完全緩解患者16名，診斷標準參照急性白血病FAB分型[4],以及1名健康志愿者，抽取患者以及志愿者的骨髓液2ml加到肝素抗凝管中。

1.2 實驗方法

1.2.1 人NB4細胞株培養 按文獻培養NB4細胞[5]。

1.2.2 引物設計和合成 PML/RARα基因引物序列和探針序列：根據PML/RARα的融合位點，軟件Primer Premier 1.0設計檢測PML/RARα融合基因的引物和探針，上游引物在PML上，下游引物在RARa上，擴增片段為122 bp，引物序列和探針序列如下：上游引物(FP)為:5’-ccg tca tag gaa gtg agg tct-3’ 、下游引物(RP)為:5’-ggc tgg gca cta tct ctt ca-3’、探針(PP)為：5’-ctg ctc tgg gtc tca atg gct gcc tcc-3’，用FAM標記；ABL基因引物序列和探針序列：檢測ABL的引物，為了避免基因組的污染，在設計上跨外顯子，我們在設計ABL引物是上游引物在3號外顯子上，下游引物在4號外顯子上，擴增的目的片段長120bp，引物序列和探針序列如下：上游引物(FA)為：5’-tcc atc tcg ctg aga tac gaa g-3’ 、下游引物(RA)為：5’-atg atg aac caa ctc ggc ca-3’、探針(PA)為：5’-caa cac tgc ttc tga tgg caa gct cta cg-3’，用VIC標記。引物和探針均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3 單重及雙重熒光定量PCR反應體系的建立

1.2.3.1 退火溫度 通過定性PCR技術優化檢測PML/RARa和ABL的溫度條件，特別是退火溫度，獲得一個既能擴增出PML/RARα，又能擴增出ABL的條件。

1.2.3.2 Mg2+濃度 固定反應體系中其余試劑成分不變，Mg2+濃度梯度遞增進行單重熒光定量PCR，尋找最佳的Mg2+濃度。

1.2.3.3 引物濃度 固定反應體系中其余試劑成分不變，引物濃度梯度遞增進行單重熒光定量PCR，尋找最佳的引物濃度。

1.2.3.4 通過Mg2+和引物濃度梯度擴增，尋找出最佳的Mg2+和引物濃度，建立本研究的單重熒光定量PCR反應體系，并在此基礎上建立雙重熒光定量PCR反應體系。

1.2.4 單重及雙重熒光定量PCR反應體系性能評價

1.2.4.1 反應體系分析靈敏度評價 (1)檢測質粒的靈敏度 將PCMV4-PML/RARα-ABL質粒按10倍比例進行梯度稀釋成各個梯度拷貝數，然后用本實驗室建立的單重和雙重熒光定量PCR方法進行檢測，以能夠出現檢測信號的最低質粒濃度為反應體系的檢測下限。(2)檢測NB4細胞的靈敏度①分離人骨髓單個核細胞(BMMNC)抽取2ml正常人骨髓液加到肝素抗凝管中。取一支10ml的無菌離心管，加入2ml的人淋巴細胞分離液，再將抽取的2ml骨髓液小心加在等量的淋巴細胞分離液上，室溫中，水平離心1500r/min 15min。此時離心管中形成5層，小心吸取中間的白膜層，用7～10倍體積的0.01mol/L D-Hanks液稀釋洗滌,1500r/min離心15min，洗 滌2～3次,去上清夜，再用少許DHanks液重懸，牛鮑計數板計數細胞濃度。分裝6管細胞，每管根據濃度定量為106個細胞數。②分別在6管含106個正常骨髓單個核細胞中加入不同量的 NB4 細胞(106，105，104，103，102，101)，然后提取RNA，用Trizol法提取細胞中的總RNA，紫外分光光度儀檢測RNA的濃度和純度，為逆轉錄體系RNA的定量做準備。RT體系為：5×PrimeScriptTMBuffer 2μl、PrimeScriptTMRT Enzyme Mix 1 0.5μl、Oligo dTPrime (50μM)0.5μl、Random 6 mers(100μM)0.5μl Total RNA 0.4～0.5μg RNase Free dH2O 補齊至10μl。RT 反應條件：37℃ 15min 85℃5s。獲取cDNA，再以cDNA為模板,然后用本實驗室建立的單重和雙重熒光定量PCR反應體系進行檢測，以能夠在106個背景細胞中出現檢測信號的最小NB4細胞數為本試劑的臨床靈敏度。靈敏度=NNB4×10-6。

1.2.4.2 反應體系精密度的評價 (1)批內精密度評價：分別取高(108copies/ml)、中(106copies/ml)、低(104copies/ml)三個濃度的質粒，每個濃度的質粒采用單重和雙重熒光定量PCR反應體系重復檢測5次，分別計算出高、中 低三個濃度的Ct值的平均值()，標準差(s)，以及變異系數(CV)，評價反應體系的批內精密度。(2)批間精密度評價：分別取高(108copies/ml)、中(106copies/ml)、低(104copies/ml)三個濃度的質粒，每個濃度的質粒采用單重和雙重熒光定量PCR反應體系連續檢測5d，分別計算出高、中 低三個濃度的Ct值的平均值、標準差以及變異系數，評價反應體系的批間精密度。

1.2.4.3 檢測臨床樣本陽性率一致性的評價 Trizol法提取病人骨髓液總RNA，RT后獲取cDNA，再以cDNA為模板,然后用本實驗室建立的雙重熒光定量PCR反應體系以及北京思爾成生物技術有限公司的熒光定量PCR反應試劑進行檢測，比較兩者檢測臨床樣本陽性率。北京思爾成生物技術有限公司實時熒光定量PCR反應體系：PML/RARα-L反應液和ABL反應液各8μl,混合酶液各2μl,cDNA 15μl，總體系為 25μl。 ABI7300 擴增儀擴增反應條件：94℃預變性 5min，94℃變性 15s，60℃退火/延伸60s，共40個循環。

2 結果

2.1 單重及雙重熒光定量PCR反應體系的建立根據優化好的最佳退火溫度、Mg2+濃度和引物濃度，確立單重及雙重熒光定量PCR反應體系單重熒光定量PCR反應體系:10×Reaction Buffer 2.5μl、dNTP(2.5mM)2.5μl、Mg2+(25mM)8μl、FP/FA(40μM)0.5μl 、RP/RA (40μM)0.5μl、PP/PA(10μM)0.5μl、Tap DNA Polymerase(5U/μl)0.5μl、Sterile ddH2O 1μl、質粒模板 PCMV4-PML/RARα-ABL 9μl、總體系 25μl。 RQ-PCR 擴增體系: 預變性 94℃ 2min ，94℃ 30s 、53℃ 30s、72℃ 30s 40個循環。

雙重熒光定量PCR反應體系：10×Reaction Buffer 2.5μl、dNTP(2.5mM)2.5μl、Mg2+(25mM)8μl、FP (40μM)0.5μl、FA (40μM)1μl、RP (40μM)0.5μl、RA(40μM)1μl、PP(10μM)0.5μl、PA(10μM)0.5μl、Tap DNA Polymerase(5U/μl)0.5μl、質粒模板 PCMV4-PML/RARα-ABL 7.5μl、總體系 25μl。RQ-PCR擴增體系:預變性 94℃2min，94℃ 30s、53℃ 30s、72℃ 30s 40個循環。

2.2 單重及雙重熒光定量PCR反應體系性能評價

2.2.1 反應體系分析靈敏度評價

2.2.1.1 質粒靈敏度 本實驗室建立的單重和雙重熒光定量PCR方法(反應體系如上述所示)進行檢測，能夠檢測到的最低質粒濃度都為103copies/ml，103copies/ml以下濃度未能檢測到擴增信號，其Ct值與以上不同濃度標準品的對數值擬合作圖得出的標準曲線顯示，Ct值和模板起始濃度對數值之間具有較好的線性關系r2≥0.99。見圖1。

圖1 PML/RARα和ABL濃度梯度標準曲線(雙重熒光定量PCR方法)

2.2.1.2 檢測NB4細胞的靈敏度 本實驗室建立的單重和雙重熒光定量PCR反應體系進行檢測，能夠出現檢測信號的最小NB4細胞數為103，靈敏度=NNB4×10-6=103×10-6=10-3，6 管細胞中， 能夠出現檢測信號的最小NB4細胞數為103個，NB4細胞數為102,101個未能檢測到擴增信號，故本擴增體系的臨床靈敏度=103×10-6=10-3。也就是1000個正常的背景細胞中只要有1個APL細胞就能檢測到。

單重熒光定量PCR反應體系和雙重熒光定量PCR的檢測NB4細胞靈敏度一致，能夠出現檢測信號的最小NB4細胞數都為103個(圖略)。

2.2.2 反應體系精密度評價

2.2.2.1 單重和雙重熒光定量PCR反應體系批內精密度評價 如表1所示高、中、低三個濃度的質粒，無論是單重還是多重熒光定量PCR，其Ct值的變異系數CV都小于5%，故批內精密度好，試劑批內重復檢測較為穩定。

2.2.2.2 單重和雙重熒光定量PCR方法批間精密度評價如 表2所示高、中、低三個濃度的質粒，無論是單重還是多重熒光定量PCR，其Ct值的變異系數CV雖比批內精密度要大，但也都小于5%，故批間精密度較好，試劑批間重復檢測較為穩定。

表1 批內精密度評價表

表2 批間精密度評價表

2.2.3 檢測臨床樣本陽性率一致性的評價 雙重熒光定量PCR反應體系檢測確診為20例APL病人(4例初治，16例形態學完全緩解病人)，其檢測臨床樣本陽性率，和北京思爾成生物技術有限公司的單重熒光定量PCR反應試劑一致。兩試劑盒的比較結果見表3。

表3 雙重熒光定量PCR體系和思爾成試劑盒檢測樣本結果的比較

20 位病人中，4例初治病人PCR結果均為陽性，其余16例病人，檢測到4例陽性。其余12例未能檢測到擴增信號。即初治病人檢測的陽性率是100%，MRD的病人陽性檢出率為25%,圖略。

用北京思爾成生物技術有限公司的單重熒光定量PCR反應試劑對這20例病人的mRNA進行檢測(圖略)，思爾成試劑盒和雙重PCR檢測結果總符合率為100%，陽性檢出率為40%，陰性檢出率為60%，Kappa值為1，表示結果完全一致。故本實驗構建的雙重體系能夠用于臨床診斷急性早幼粒白血病，且能對PML/RARα融合基因的拷貝數進行動態監測，在用藥指導、預后觀察及MRD診斷方面發揮重要作用。并且該方法在一個反應體系中檢測兩個基因，可以減少試劑的用量，同時減少操作步驟和操作誤差，大大減少實驗成本和實驗時間。

3 討論

在進行單重及雙重熒光定量PCR反應體系設計時，主要從四個關鍵因素考慮：(1)Mg2+濃度，Mg2+是Taq DNA聚合酶活性所必需的,酶的量一般2U足夠進行定量PCR,最重要的是酶的活性，而Mg2+濃度除影響酶活性外,也影響引物的退火,模板與PCR產物的解鏈溫度,產物的特異性,引物二聚體的形成等。Mg2+濃度過低時,酶活力明顯降低;過高時,酶可催化非特異性擴增，故Mg2+濃度是要優化的關鍵因素。(2)引物濃度，適當的引物濃度可以提高反應體系的靈敏度，但是不能過高，否則也會引起非特異性擴增。(3)退火溫度，合適的退火保證所有引物同等雜交。過高時，可能無法擴增出目的條帶，過低時，會引起非特異性擴增。(4)Hot-start策略：本實驗沒有使用熱啟動酶，為了降低實驗成本，采取人工熱啟動的辦法，即加樣以及上機之前都是在冰盒中操作以使酶活性最低。Mg2+濃度，引物濃度，退火溫度都進行了系統的優化，且擴增產物進行定量分析后，上樣于1.5%瓊脂糖凝膠平板電泳上，結果只見目的條帶和少量的引物二聚體(圖略)，未見其它非特異性擴增，故Mg2+濃度，引物濃度，退火溫度基本已優化到最佳。

本實驗室構建的單重以及雙重熒光定量PCR反應體系臨床性能評價結果顯示，兩者在質粒靈敏度，檢測NB4細胞的靈敏度，批內批間精密度上都無明顯差異，而雙重反應體系以其減少試劑的用量，減少操作步驟和實驗的時間等優點能夠更好地用于臨床診斷。本實驗室收集了20例APL的病人，分別用雙重熒光定量PCR和市面上的單重試劑進行檢測，診斷陽性率一致，故本實驗成功開發出了穩定的雙重熒光定量PCR檢測試劑盒。

[1]袁 宏,王 楠,李士軍.實時熒光定量PCR檢測PML/RARα融合基因的臨床應用研究[J].中華檢驗醫學雜志,2007,30(4):410-414.

[2]de The H，Chomienne C，Lanotte M，et al.The t(15;17)translocation of acute promyelocytic leukemia fuses the retinoic acid receptor α gene to a novel transcribed locus[J].Nature,1990,347:558-661

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[4]許文榮 王建中.臨床血液學與檢驗[M].北京：人民衛生出版社，2007:241.

[5]江 梅，簡正偉，羅 清,等.含 PML/RARα(L型)與 ABL雙基因質粒標準品的制備及應用 [J].實驗與檢驗醫學，2011,29(5):482-485.

Establishment of duplex real-time PCR method for PML/RARα fusion gene detection

JIANG Mei,WAN Lagen,JIAN Zhengwei,et al.Department of Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 330006,China

ObjectiveTo establish a duplex real-time quantitative PCR method for respective detection of PML/RARα fusion gene and ABL gene in one reaction system.MethodsWe optimized the method from several aspects,such as DNA polymerase concentration,Mg2+concentration,primer concentration and so on after its establishment.The reaction performance of duplex real-time quantitative PCR system was assessed mainly from the analysis sensitivity,within-run precision,between-run precision,and positive rate in clinical samples detection.Additionally,the method was also compared with Beijing Siercheng biological limited company's PCR reagent kit and the consistency was analyzed between them.ResultsWe established duplex realtime quantitative PCR reaction system successfully.The detection sensitivities of plasmid and NB4 cell were 103copies/ml and 10-3,respectively.The CV values of within-run,between-run precision and Ct value were all less than 5%.The positive rate was in agreement with Beijing Siercheng biological Limited company's PCR reagent kit when we detected 20 APL patients using the method.ConclusionWe have successfully developed a stable duplex real-time quantitative PCR reagent kit with advantages as simple operation,low cost,and low inaccuracy.It can be effectively used for APL molecular typing diagnosis,medication guide,prognosis and MRD monitoring.

Real-time quantitative PCR；PML/RARα； ABL； Acute promyelocytic leukemia

R733.7,R73-35+

A

1674-1129(2012)05-0433-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2012.05.005

江西省衛生廳科研項目,編號20111022

江梅，女，1986年出生,畢業于南昌大學醫學院，碩士研究生，檢驗醫師，專業是臨床檢驗診斷學，主要從事血液學分子診斷的研究。