訶子提取物清除自由基活性研究

2012-01-17 06:02:28張耀華周紅審陳麗華

中國煙草科學 2012年6期

劉鑫，熊斌，張耀華，周紅審，陳麗華

（1.湖北中煙工業(yè)有限責任公司技術(shù)中心，武漢 430051；2.河南平頂山工學院，河南平頂山 467036）

近年來，有關(guān)吸煙與健康的研究結(jié)果表明，卷煙煙氣自由基可直接損傷機體內(nèi)細胞和酶等物質(zhì)，并與DNA結(jié)合使細胞轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生突變；其間接毒性可在體內(nèi)激活和產(chǎn)生大量活性更高、毒性更大的其他自由基，如超氧自由基和羥基自由基，從而導致多種病變[1]。目前，合成抗氧化劑往往有毒副作用，它們逐步被取代是大勢所趨。因此，開發(fā)出高效無毒的天然自由基清除劑應用于卷煙制品，對于降低吸煙的危害具有十分重要的意義。

訶子系君子科植物訶子樹（Terminalia ChebulaRitz）的果實，原產(chǎn)印度、緬甸等國，在西藏、云南等省區(qū)均有分布。《藥性論》記載其“味酸澀、溫無毒”，有斂肺、澀腸、下氣之功效。藥理試驗表明，訶子具有明顯的抗艾滋病、抑制惡性腫瘤、抑菌等作用，它含有約30%～40%[2]的鞣質(zhì)，而訶子鞣質(zhì)具有良好的抗氧化功能[3-6]。訶子在醫(yī)藥及油脂抗氧化方面的研究較多，而對降低香煙煙氣自由基含量的應用報到較少[7-8]，且多為粗提物，作用成分不明。本研究對訶子提取物進行色譜純化，并通過顯色反應、UV和H1NMR檢測后確認其清除自由基的活性物質(zhì)主要為訶黎勒酸衍生物或訶子單寧水解碎片等，為訶子提取物作為煙用自由基清除劑提供了有效的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

訶子購于中藥城，DPPH·購于Sigma-Aldrich公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。試驗于2008—2009年進行。

1.2 主要儀器及設(shè)備

721紫外可見分光光度計；ZF-C三用紫外分光計；TGL-18C高速臺式離心機；HG101-1B電熱鼓風干燥箱；2110 Fraction collector離心沉淀器。

1.3 方法

1.3.1 訶子中清除自由基活性成分的提取與分離200 g訶子粉（粉碎至40目）以甲醇回流提取2次（固液比1:6），每次2 h，合并濾液，濃縮至浸膏狀，浸膏用乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮至干，稱重，定容并計算得率和濃度。

1.3.2 顯色法跟蹤試驗根據(jù)三氯化鐵溶液、茴香醛-硫酸、亞硝酸鉀-醋酸溶液、碘酸鉀飽和溶液、α-萘酚等顯色試驗[9]來判斷其主要成分類別。

1.3.3 DPPH·法活性跟蹤試驗將提取物（分別以提取劑為溶劑）、茶多酚和特丁基對苯二酚（TBHQ，以甲醇為溶劑）分別配成5個濃度梯度溶液。再將DPPH·用各對應溶劑分別配成1×10-4mol/L的溶液7份。取2 mL不同濃度的樣品溶液分別加入到2 mL相對應的 D P P H·溶液中，總體積4 mL，搖勻，25 ℃保溫30 min，于517 nm測定吸光值（A樣品）（以2 mL樣液+2 mL對應溶劑混合調(diào)零）。2 mL相應溶劑加到2 mL DPPH·液中空白對照，測定空白的吸光值（A空白）（以4 mL對應純?nèi)軇┱{(diào)零）[10]。

計算抑制率公式為：

抑制率（%）=（A空白－A樣品）/A空白×100%

1.3.4 乙酸乙酯和甲醇組分的色譜純化分別對乙酸乙酯和甲醇組分進行硅膠柱層析，從乙酸乙酯組分得色譜純組分a和b；甲醇組分得到色譜純組分c。

1.3.5 色譜純成分的結(jié)構(gòu)鑒定對a、b、c溶液進行顯色試驗、紫外（UV）和核磁共振法（H1NMR）進行結(jié)構(gòu)鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 濃度和得率

按照試驗方法對訶子進行分步提取，甲醇提取物和乙酸乙酯得率分別為40.8%和4.18%。

2.2 甲醇和乙酸乙酯提取物的活性跟蹤

2.2.1 顯色反應跟蹤提取物組分顯色試驗結(jié)果見表1。

2.2.2 DPPH·法活性跟蹤采用DPPH·法活性跟蹤法測定不同濃度下的A值，計算其抑制率，并繪制其抑制率曲線如圖1。

觀察抑制率曲線發(fā)現(xiàn)：（1）TBHQ和甲醇組分的抑制率較高，但隨濃度升高數(shù)值變化不大，即對自由基的清除效果的量效關(guān)系并不明顯。（2）茶多酚和乙酸乙酯組分呈上升狀，表明其活性與濃度成正比關(guān)系，但乙酸乙酯組分清除自由基的活性弱于茶多酚。

2.3 乙酸乙酯和甲醇組分的色譜純化

乙酸乙酯和甲醇提取物顯色試驗中均呈現(xiàn)不同程度的藍綠色，說明均含有多酚類物質(zhì)，進一步對乙酸乙酯和甲醇提取物進行硅膠柱層析。柱層析純化過程中，采用薄層分析板三氯化鐵顯色跟蹤，最后得色譜純兩個純組分，重量分別為2.689 g和0.026 g，用甲醇分別定容到 50 mL后，濃度各為53.79 g/L和0.52 g/L，分別命名為樣a和b。甲醇組分色譜純化后重0.385 g，用甲醇定容50 mL，其濃度為7.04 g/L，命名為樣c。

表1 兩組分顯色試驗結(jié)果Table 1 The color test of the purified components

圖1 甲醇組分、乙酸乙酯組分、茶多酚及TBHQ對DPPH·的抑制活性Fig.1 Methanol fractions, the ethyl acetate fractions, tea polyphenol and TBHQ on DPPH· inhibitory activity

2.4 色譜純組分清除自由基活性檢測和化學成分定性鑒定

2.4.1 顯色法定性鑒定濾紙層析和 α-萘酚法對色譜純組分a、b、c顯色，其結(jié)果如表2和圖2所示。條形紙層析在BAW 和 6%的冰乙酸中展開，并在紫外燈254 nm下觀察，其顯色結(jié)果見表3。

綜合表2、3的顯色結(jié)果，可以推斷樣a屬水解單寧中的棓單寧，是多個棓酸與鄰苯三酚型酚羥基醇形成的六羥基聯(lián)苯二酸酯；樣b為縮合單寧，由于含有鄰苯二酚的單寧在三氯化鐵溶液顯色下才呈綠色，它是羥基黃烷類單體形成的縮合物，單體間以碳-碳鍵連接，遇濃硫酸生成暗紅棕色沉淀；樣c的紙層析在紫外燈254 nm下觀察呈紫色[11]，在BAW的上層和6%的醋酸中它們的Rf值分別為0.42和0.12，這與葡萄糖棓酸酯在紫外光下的呈色以及紙色譜上以BAW為展開劑的比移值（Rf）大體相近，至于6%的醋酸為展開劑時，其Rf值隨分子中棓酰基的個數(shù)增加而下降。根據(jù)上述推測，它的結(jié)構(gòu)應為 1β,2,3,4,6-五-O-棓酰-β-D-吡喃葡萄糖。

表2 色譜純組分a、b、c顯色情況Table 2 The color test of the purified components

圖2 色譜純組分濾紙層析樣圖Fig.2 Chromatography paper chromatography sample of the purified components

表3 條形紙層析顯色結(jié)果Table 3 The color test of the strip paper chromatography

2.4.2 紫外（UV）和核磁（NMR）結(jié)構(gòu)測定結(jié)果從紫外圖譜上觀察，a樣的UV（MeOH）的波峰為219、202.5、275 nm，b樣UV（MeOH）的波峰為200、220 nm，c樣的UV（MeOH）的波峰為274、205、222.5 nm。根據(jù)參考文獻[2]中的數(shù)據(jù)，a樣與訶黎勒酸的波峰相對應，可大概判斷為訶黎勒酸。b樣和c樣的紫外波峰數(shù)據(jù)沒有記載，但b和c的顯色反應表明它們具有訶子單寧的特征，結(jié)合核磁圖譜（圖3、4）分析推測，它們屬訶子大家庭中的一員，是訶黎勒酸的變體或訶子單寧的水解碎片。組分 b和c的推測結(jié)構(gòu)見圖5、6。