代謝型谷氨酸受體5在大鼠顳下頜關節疼痛中的作用

李波，盧利，譚學新，劉純義，易新，劉焱

（中國醫科大學口腔醫學院 1.口腔解剖生理教研室；2.口腔頜面外科，沈陽 110002）

顳下頜關節紊亂病（temporomandibular joint disorders，TMD）是一種常見病和多發病，涉及顳下頜關節和咀嚼肌系統，是具有相關臨床問題的一組疾病的總稱［1］。以關節疼痛、彈響和開口受限為主要臨床癥狀，其中疼痛是多數TMD患者就診的主要原因，但關于疼痛的病理生理機制尚未清楚［2］。

Ⅰ型代謝型谷氨酸受體5（metabtrophic glutamate receptor subtype 5，mGluR5）是谷氨酸受體的一種，近年研究表明其參與多種疼痛過程［3～6］。MPEP是一種特異性的mGluR5拮抗劑，可以特異性抑制mGluR5激活，而對Ⅰ型代謝型谷氨酸受體的其他亞型無抑制作用［7］。有學者研究證實MPEP可以緩解外周神經損傷造成的神經病理性疼痛［8，9］。本研究擬通過建立甲醛誘導的大鼠顳下頜關節疼痛模型，觀察大鼠傷害性反應行為變化，探討mGluR5在甲醛誘導的炎性疼痛中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要儀器與試劑

成年雄性SD大鼠36只，體質量180～220 g，由中國醫科大學實驗動物中心提供。動物使用符合動物倫理委員會標準及要求。儀器包括：精密電子天平、普通電子天平（北京聯動盈創科技發展公司）、721型可見分光光度儀（上海精科實業有限公司）；多聚甲醛和MPEP（美國Sigma公司）、戊巴比妥鈉（上海易利生生物制劑）、5%甲醛注射液（37%甲醛原液與生理鹽水混合配制而成）。

1.2 方法

1.2.1 分組：將大鼠編號，按照隨機分配表隨機分為6組，每組6只。分為：正常對照組（未作任何處理）、陰性對照組（生理鹽水注射）、甲醛組（5%甲醛注射）、MPEP-1組［5%甲醛注射+MPEP（1 mmoL/L）注射］、MPEP-2組［5%甲醛注射+MPEP（2.5 mmoL/L）注射］、MPEP-3組［5%甲醛注射+MPEP（5 mmoL/L）注射］。每籠6只大鼠，在室溫（23±1）℃環境內，自由進食，晝夜交替規律循環，飼養1周，然后置于30 cm×30 cm×30 cm一側透明木箱內，玻璃對側置攝像頭記錄動物的傷害性行為反應。實驗在早8：30至晚5：00之間進行。

1.2.2 顳下頜關節腔內注射及大鼠傷害性行為觀測：乙醚吸入麻醉下（劑量以能夠完成顳下頜關節腔內注射即可），觸摸顴弓后下方，在SD大鼠右側顳下頜關節腔內用微量注射器吸入50 μL注射液，循顴弓后方立即進針，然后向前直至髁狀突后外側注射藥物，針于原位停留1 s防止藥物外滲。MPEP組分別于建模型前20 min注射1，2.5，5 mmoL/L MPEP 25 μL。藥物注射后30 s動物立刻蘇醒，回到測試空間。觀察大鼠傷害性行為，包括退縮、搖頭及刮擦頭面部，記錄刮擦頭面部及縮頭反應持續時間。連續觀察60 min，每隔3 min計數動物的反應持續時間。所有測試均采用雙盲法，即1人注射，另外1人觀察動物的行為學變化。

1.2.3 大鼠顳下頜關節區Evan′s藍結合血漿蛋白滲出量測定：動物在戊巴比妥鈉麻醉下（40 mg/kg，ip）將 Evan′s藍染料（0.1%，5 mg/kg）注入右側股靜脈，10 min后，用肝素+生理鹽水灌注，切取關節組織，稱重，貯存在-20℃冰箱備用。關節組織在丙酮和5%硫酸鈉混合物（7∶3）室溫下孵育過夜。孵育后樣品以300 r/min離心10 min，用分光光度計在波長620 nm下分析染料存在的數量。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 甲醛誘導顳下頜關節疼痛大鼠的傷害性行為反應

結果可見，大鼠傷害性行為反應持續時間在正常組為（78.5±11.6）s，生理鹽水組為（88.5 ±10.5）s，并未觀察到大鼠退縮及將頭轉向注射側，2組比較差異無統計學意義（P>0.05）。而在各實驗組，動物縮頭及轉頭持續時間明顯高于正常組及生理鹽水注射組。甲醛注射后，甲醛組大鼠表現為刮擦頭面部及縮頭反應，60 min內總的傷害性行為反應持續時間達（472.3±34.2）s，與正常組比較差異有統計學意義（P<0.05）。預先注射MPEP后動物的傷害性反應減少，呈劑量依賴性，MPEP-1、MPEP-2、MPEP-3 組傷害性行為反應持續時間分別為（462.4±14.3）s、（403.2±15.0）s、（184.1±27.0）s。與甲醛組比較，MPEP-1 組和MPEP-2組大鼠傷害性行為反應沒有統計學差異（P>0.05），而MPEP-3組的傷害性行為反應明顯低于甲醛組，差異有統計學意義（P<0.05）。

2.2 各組大鼠顳下頜關節血漿蛋白滲出量比較

結果可見，大鼠顳下頜關節內血漿滲出量正常對照組為（2.56±0.89）μg/g，生理鹽水組為（2.61±0.43）μg/g，2組比較差異無統計學意義（P>0.05）。注射甲醛后，甲醛組大鼠顳下頜關節內血漿滲出量明顯增加，為（20.32±2.12）μg/g，與正常對照組比較差異有統計學意義（P<0.001）。注射MPEP后大鼠顳下頜關節內血漿滲出量減少，MPEP-1組、MPEP-2組和 MPEP-3 組分別為（19.06±0.25）μg/g、（18.56±1.59）μg/g、（9.42±1.49）μg/g，與正常對照組比較，MPEP-1組、MPEP-2組和MPEP-3組血漿滲出量增加，差異有統計學意義（P<0.05）；MPEP-3組與模型組比較，血漿滲出量明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

流行病學研究［10］表明，人群中5.3%存在顳下頜關節痛。TMD患者面部不適和疼痛反復發作，在頭痛個體中，有14%～26%為TMD導致的疼痛。TMD已經成為慢性頭痛和面部痛的原因之一。甲醛作為傷害性刺激因子，可引起急性疼痛。已廣泛用于研究疼痛機制的行為學實驗，可很好地模擬炎性痛［11］。本實驗將甲醛注射液注入顳下頜關節腔內，造成關節局部刺激痛。本研究成功建立大鼠顳下頜關節疼痛模型，從而能夠觀察到動物明顯出現刮擦頭面部、縮頭等傷害性行為反應。

甲醛致痛的典型特征是形成雙相痛［12］。前5 min為第一相，20～60 min為第二相。第一相注射開始即產生，持續時間短，認為是由于甲醛注射本身刺激造成的，有時會由于動物尚未蘇醒無法記錄。本實驗前5 min并未監測出明顯的傷害性行為反應，認為可能是麻醉掩蓋了第一相所致。因此本實驗觀察第二相反應變化。結果顯示，注射生理鹽水組與正常對照組之間無統計學差異（P>0.05）。注射甲醛后，大鼠傷害性行為反應持續時間明顯高于正常對照組和生理鹽水組（P<0.05），與將甲醛注射液注入口唇部研究結果相似［14］。在正常組及生理鹽水注射組未觀察到大鼠退縮及將頭轉向注射側；實驗組動物縮頭及轉頭持續時間明顯高于正常組及生理鹽水注射組，這與臨床上看到的口頜面疼痛患者經常將頭轉向患側相似。

機體發生炎癥時損傷部位出現局部血管擴張、血流增多、水腫和滲出等現象。將Evan′s藍注入循環系統，使其與血漿蛋白結合，在炎癥部位Evan′s藍可隨血漿滲出到皮下。本研究結果顯示，注射甲醛后，甲醛組大鼠顳下頜關節內血漿滲出量明顯增加，與正常對照組比較差異有統計學意義（P<0.001），說明甲醛注射液注入顳下頜關節腔內可造成關節局部刺激痛。與正常對照組比較，注射MPEP后大鼠顳下頜關節內血漿滲出量減少（P<0.05）；而與甲醛組比較，各MPEP組血漿滲出量明顯降低（P<0.01）。認為外周注射甲醛能導致顳下頜關節炎性滲出，并迅速引起外周谷氨酸等神經遞質釋放，預先注射代謝型谷氨酸受體拮抗劑可以明顯減少Evan′s滲出量。

綜上所述，本實驗表明甲醛誘導的顳下頜關節疼痛可以激活代謝型谷氨酸受體5，特異性應用其抑制劑可以明顯減輕炎性痛。下一步要探討代謝型谷氨酸受體在甲醛誘導的顳下頜關節炎性痛中的作用機制，為進一步闡明顳下頜關節疼痛機制提供依據。

［1］馬緒臣.顳下頜關節病的基礎與臨床［M］.北京：人民衛生出版社，2004：179.

［2］傅開元.顳下頜關節及口頜面疼痛的治療［J］.中國實用口腔科雜志，2009，2（3）：139-143.

［3］Lee JS，Ro JY.Peripheral metabotropic glutamate receptor 5 mediates mechanical hypersensitivity in craniofacial muscle via protein kinse Cdependentmechanisms［J］.Neuroscience，2007，146（1）：375-383.

［4］Guo W，Wei F，Zou S，et al．Group I metabotropic glutamate receptor NMDA receptor coupling and signaling cascade mediate spinal dorsal horn NMDA receptor 2B tyrosine phosphorylation associated with inflammatory hyperalgesia［J］.Neuroscience，2004，24（41）：9161-9173.

［5］Jesse CR，Lucielli S，Cristina W，et al.Effect of ametabotropic glutamate receptor 5 antagonist，MPEP，on the nociceptive response induced by intrathecal injection of excitatory aminoacids，substance P，bradykinin or cytokines in mice［J］.Pharmacol Biochem Behavior，2008，90（4）：608-613.

［6］Ahn DK，Lee HJ，Choi HS，et al.Peripheral mGluR5 antagonist attenuated craniofacial muscle pain and inflammation but not mGluR1 antagonist in lightly anesthetized rats［J］.Brain Res Bulletin，2008，76（1）：8-15.

［7］Inta D，Filipovic D，Lima-ojeda JM，et al.The mGlu5 receptor antagonist MPEP activates specific stress-related brain regions and lacks neurotoxic effects of the NMDA receptor antagonist MK-801：significance for the use as anxiolytic/antidepressant drug［J］.Neuropharmacology，2012，62（5-6）：2034-2039.

［8］Sotgiu MI，Bcuomi P，Biella CE.The mGluR5 selective antagonist 6-methyl-2-cherylethnayl-pyridine reduces the spinal neuron pain-related activity inmono neuropathic rats［J］.Neurosci LCA，2003，342（1-2）：85-94.

［9］Bhave G，Karim F，Carlton SM，et al.Peripheral group I metabotropic glutamate receptors modulate nociception in mice［J］.Nat Neurosci，2001，4（4）：417-423.

［10］Rammepsberg P，Leresche L，Dworkin S，et al.Longitudinal outcome of temporomandibular disorders：A 5-year epidemiologic study of muscle disorders defined by research diagnostic criteria for temporomandibular disorders［J］.J Orofacial Pain，2003，17（1）：9-20.

［11］Imbe H，Iwata K，Zhou QQ，et al.Orofacial deep and cutaneous tissue inflammation and trigeminal neuronal activation.Implications for persistent temporomandibular pain［J］.Cells Tissues Organs，2001，169（2）：238-247.

［12］楊勇，郭曲練，鄒望遠，等.鞘內注射氯胺酮對甲醛炎性疼痛大鼠脊髓背角蛋白激酶C表達的影響［J］.南方醫科大學學報，2011，31（3）：461-464.

［13］List T，Axelsson S，Leijon G.Pharmacologic interventions in the treatment of temoromandibular disorders，a typical facial pain and burning mouth syndrome.A qualitative systematic review［J］.J Orofacial Pain，2003，17（4）：301-310.