應(yīng)用組織芯片技術(shù)檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中KAI1/CD82和ME491/CD63的表達(dá)

季潤(rùn)元，史恩溢，王永實(shí)，李小寧，趙玉芳，馮振卿

（1.江蘇省淮陰衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，淮安市消化道腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 淮安 223300；2.江蘇省蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院病理教研室，江蘇 蘇州 215009；3.江蘇省淮安市腫瘤醫(yī)院病理科，江蘇 淮安 223200；4.南京醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系，南京 210029）

跨膜4超家族（transmembrane 4 superfamily，TM4SF）是結(jié)構(gòu)上屬于細(xì)胞膜糖蛋白的特殊家族，該家族中有 5個(gè)成員即 MRP1/CD9、ME491/CD63、KAI1/CD82、CD151和CD81，與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、增殖和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)［1］。KAI1（kang ai 1）基因是美籍華人DONG于1995年發(fā)現(xiàn)的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因［2］，KAI1基因?qū)^大多數(shù)腫瘤的轉(zhuǎn)移起抑制作用，與腫瘤的侵襲力、預(yù)后明顯相關(guān)。KAI1編碼區(qū)編碼267個(gè)氨基酸殘基、分子量為29.6 kDa的蛋白質(zhì)，與已發(fā)現(xiàn)的CD82結(jié)構(gòu)相同。CD82是一種白細(xì)胞表面糖蛋白，屬于跨膜4超家族（TM4SF）成員［3］。黑色素瘤相關(guān)抗原ME491（melanoma associated antigen ME491）在腫瘤早期進(jìn)展過(guò)程中高度表達(dá)。CD63最初報(bào)道與血小板激活有關(guān)，是一種溶酶體糖蛋白，存在于多種類(lèi)型細(xì)胞表面，研究最多的是在人黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)。序列分析發(fā)現(xiàn)ME491和CD63是相同的。KAI1/CD82、ME491/CD63屬于跨膜4超家族（TM4SF）成員，目前認(rèn)為與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)［4］。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集江蘇省淮安市腫瘤醫(yī)院2005-2010年結(jié)直腸癌手術(shù)切除標(biāo)本232例，男性119例（51.3%），女性113例（48.7%）。結(jié)直腸癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)按WHO腸道腫瘤組織學(xué)分型進(jìn)行，所有樣本切片均經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)。病理分型均為腺癌，其中高分化34例，中分化154例，低分化44例。Dukes分期：A期10例、B期127例、C期73例、D期22例。所有患者均無(wú)腸癌家族遺傳史，術(shù)前均未接受過(guò)放化療。

1.2 組織芯片構(gòu)建

所有病例的腫瘤組織標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。依據(jù)HE切片確定具有代表性的病變部位，應(yīng)用自有專(zhuān)利技術(shù)（專(zhuān)利號(hào)200920350099.2）組織芯片構(gòu)建儀制備組織芯片。主要步驟如下：用構(gòu)建儀在選取的組織蠟塊中穿取組織，直徑1.5 mm。應(yīng)用自有的組織芯片制備系統(tǒng)（包括組織芯片包埋底模、組織芯片膠、組織芯片陣列模、一次性加取樣針及其配套使用的針芯和針帽、定位冷卻器以及植芯器等組成部分）依次按序操作，成功制成含有232例結(jié)直腸癌的組織芯片蠟塊，每個(gè)病例均含有2個(gè)原發(fā)灶腫瘤組織。用德國(guó)LEICA石蠟切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片，厚度為4 μm。

1.2 主要試劑

鼠抗人KAI1/CD82購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，鼠抗人ME491/CD63單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，MaxVision試劑盒、DAB酶底物顯色試劑盒等試劑購(gòu)自福州邁新公司。

1.3 方法

KAI1/CD82和ME491/CD63染色方法為MaxVison兩步法，嚴(yán)格按照MaxVision染色試劑盒中說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。KAI1/CD82和ME491/CD63工作濃度為1∶50。結(jié)直腸癌組織芯片常規(guī)脫蠟水化，加一抗之前1 mmol/L EDTA（pH 8.0）水浴修復(fù)20 min。而后加一抗4℃冰箱過(guò)夜，第2天切片恢復(fù)室溫后，加MaxVision二抗溫箱培育30 min，DAB顯色，蘇木精襯染。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含棕褐色顆粒者為KAI1/CD82和ME491/CD63陽(yáng)性細(xì)胞。按陽(yáng)性細(xì)胞占鏡下腫瘤細(xì)胞的百分比將陽(yáng)性強(qiáng)度分為4個(gè)等級(jí)，分別是無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為（-），陽(yáng)性細(xì)胞占<25%為（+），25%～50%為（++），>50%為（+++），（-）～（+）記為陰性，（++）～（+++）記為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

將所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)輸入SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包，KAI1/CD82和ME491/CD63表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理因素之間的相互關(guān)系應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，KAI1/CD82和ME491/CD63表達(dá)之間的相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman相關(guān)分析。以α=0.05作為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織芯片

464個(gè)組織點(diǎn)陣排列整齊，HE、免疫組化染色均勻，無(wú)掉片、脫片、扭曲和重疊現(xiàn)象。

2.2 KAI1/CD82和ME491/CD63在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)情況

KAI1/CD82和ME491/CD63免疫組化陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物均主要定位于細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞膜（圖1，圖2）。KAI1/CD82陽(yáng)性者117例，陰性者115例，陽(yáng)性表達(dá)率為50.4%。ME491/CD63陽(yáng)性者204例，陰性者28例，陽(yáng)性表達(dá)率為87.9%。

2.3 KAI1/CD82和ME491/CD63表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

KAI1/CD82的表達(dá)與結(jié)直腸癌的分化程度和Dukes分期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，KAI1/CD82在中-高分化、Dukes A+B+C期結(jié)直腸癌的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于低分化、Dukes D期結(jié)直腸癌（53.7%vs 36.4%，P＜0.05；52.9%vs 27.3%，P＜0.05，表 1），而與患者的性別、年齡及癌組織浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）；ME491/CD63的表達(dá)與患者的性別、年齡及癌組織浸潤(rùn)深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Dukes分期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表 1）。

表1 KAI1/CD82和ME491/CD63表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationships between the expression ofKAI1/CD82，ME491/CD63 and their clinicopathological characteristic in colorectal carcinoma

2.4 MRP1/CD9和ME491/CD63在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)關(guān)系

本研究對(duì)KAI1/CD82和ME491/CD63的表達(dá)進(jìn)行Spearman相關(guān)分析。結(jié)果表明，232例結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中，KAI1/CD82和ME491/CD63在結(jié)直腸癌中的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.136，P＜0.05）。

3 討論

KAI1/CD82在其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用發(fā)現(xiàn)之前，是作為一種白細(xì)胞膜糖蛋白被認(rèn)識(shí)的。Dong等［2］將KAI1cDNA轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移的鼠黑色素瘤細(xì)胞系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)KAI1的克隆吞噬能力及侵襲能力均下降，而且這些改變均呈劑量效應(yīng)關(guān)系。表達(dá)KAI1的克隆細(xì)胞在裸鼠肺內(nèi)形成的轉(zhuǎn)移克隆數(shù)也較親代明顯減少。這些都說(shuō)明KAI1/CD82具有直接的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用。KAI1/CD82的表達(dá)缺失或下調(diào)已經(jīng)在多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)，如肺癌［3］、胃癌［4］、胰腺癌［5］、乳腺癌［6］、膀胱癌［7］等。本研究發(fā)現(xiàn)，KAI1/CD82 在低分化結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著低于高分化癌組織，且Dukes D期癌組織中KAI1/CD82的表達(dá)低于Dukes A、B、C期癌組織。說(shuō)明分化越差、惡性程度越高的結(jié)直腸癌細(xì)胞，KAI1/CD82蛋白表達(dá)缺失的越多。

本研究顯示結(jié)直腸癌中KAI1/CD82的表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)關(guān)（P>0.05）。其中，研究結(jié)果所顯示的結(jié)直腸癌中KAI1/CD82的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，這不同于國(guó)內(nèi)外絕大部分研究的結(jié)論。目前國(guó)內(nèi)外的研究均認(rèn)為KAI1/CD82是腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制基因，腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)表達(dá)下調(diào)。作者以前在食管癌［8］和胃癌［9］中的研究，也認(rèn)為KAI1是腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制基因。本研究嘗試用KAI1/CD82表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)不同百分比作為分組標(biāo)準(zhǔn)，均得出相同的結(jié)論，KAI1/CD82的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。Dukes A、B和Dukes C、D比較同樣沒(méi)有顯著性差別。但Dukes D期癌組織中KAI1/CD82的表達(dá)低于Dukes A、B、C期癌組織，我們可以認(rèn)為，當(dāng)結(jié)直腸癌進(jìn)展到Dukes D期才出現(xiàn)KAI1/CD82的表達(dá)下調(diào)。在樣本數(shù)量較大、實(shí)驗(yàn)判斷精確的情況下，為什么會(huì)得出這樣與其他實(shí)驗(yàn)不同的結(jié)論，值得進(jìn)一步探討。

黑色素瘤相關(guān)抗原ME491（melanoma associated antigen ME491）在腫瘤早期進(jìn)展過(guò)程中高度表達(dá)。以人重復(fù)Alu序列為探針從λ基因文庫(kù)篩選、通過(guò)DNA介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法克隆出ME491基因。ME491抗原由237個(gè)氨基酸組成，有4個(gè)跨膜區(qū)，3個(gè)N-糖基化點(diǎn)［11］。關(guān)于ME491/CD63研究最多的是在人黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)。ME491/CD63在黑色素瘤早期階段表現(xiàn)為高表達(dá)，但在正常黑色素細(xì)胞中不表達(dá)，在黑色素瘤進(jìn)展階段和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中低表達(dá)或不表達(dá)。ME491/CD63的表達(dá)與其他惡性腫瘤關(guān)系的研究，目前已見(jiàn)報(bào)道的有乳腺癌、非小細(xì)胞性肺癌、角質(zhì)上皮癌、胰腺癌［11］，上述惡性腫瘤均表達(dá)ME491/CD63，但未發(fā)現(xiàn)ME491/CD63的表達(dá)與腫瘤的分級(jí)、轉(zhuǎn)移、預(yù)后有關(guān)。也有研究認(rèn)為ME491/CD63表達(dá)與腫瘤進(jìn)展有關(guān)［4］。在本研究中，未能證明ME491/CD63表達(dá)與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移、分級(jí)、浸潤(rùn)深度、Dukes分期有相關(guān)性（P＞0.05）。

本研究的結(jié)果亦顯示KAI1/CD82和ME491/CD63的表達(dá)呈顯著相關(guān)性，未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。對(duì)KAI1/CD82和ME491/CD63及他們與腫瘤相關(guān)性的深入研究，將有助于我們進(jìn)一步揭示腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制，找到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的靶點(diǎn)或預(yù)測(cè)腫瘤患者預(yù)后的指標(biāo)。

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