RhoA蛋白在外陰鱗癌組織中的表達及臨床意義

張德宇，張士泰，歐陽玲

（中國醫科大學附屬盛京醫院婦產科，沈陽 110004）

外陰鱗癌（vulva squamous cell carcinoma，VSCC）是外陰最常見惡性腫瘤，多見于老年人，具有生長快、易復發、易誤診或被患者忽視、腹股溝部淋巴結轉移早等臨床特點，主要死因是轉移和局部復發。如果發現一些反應腫瘤侵襲和轉移傾向的標記物，用于高危人群的篩選、首次治療后療效評估、選擇針對性治療措施、設計相應靶點治療藥物，有效降低臨床復發和轉移率，將對VSCC的診斷和治療有著深刻的意義。因此，進一步篩選和檢測腫瘤相關標記物是目前外陰癌研究的重要課題之一。Rho家族蛋白是ras家族中最早被克隆出來的蛋白，它們是一組相對分子量為20～25 kDa的三磷酸鳥苷，具有GTP酶活性，被稱為Rho GTP酶，研究發現在多種惡性腫瘤中存在Rho GTP酶［1］。RhoA是Rho家族蛋白主要成員之一，具有GTP酶活性，RhoA在細胞內以活化GTP結合形式和非活化GTP結合形式間循環，發揮類似分子開關作用，是細胞內信號轉導的橋梁［2］。近年研究表明RhoA在胃癌、結直腸癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、子宮頸癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中高表達，與這些腫瘤的發生、侵襲及轉移密切相關［3～6］。但RhoA在VSCC中有無表達，目前國內外尚無報道。

本研究采用免疫組化技術檢測RhoA在VSCC組織中表達情況及其與臨床病理因素的相關性，以期為VSCC早期診斷、臨床治療及判斷預后提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源

隨機收集盛京醫院及遼寧省腫瘤醫院2006年3月至2011年12月間經病理證實、臨床資料完整、有隨訪記錄的40例住院治療的VSCC組織石蠟標本作為實驗組。另選取10例外陰鱗狀上皮內腫瘤2級（vulva intraepithelial neoplasiaⅡ，VINⅡ）10例、外陰手術切緣周圍正常皮膚10例組織標本作為對照組。所有標本均經10%中性甲醛固定，常規HE制片。實驗組：40例患者年齡36～81歲，中位年齡為56歲，對照組年齡44～76歲，中位年齡54歲，兩組年齡比較差異無統計學意義。組織學分級：鱗狀細胞癌28例，低分化鱗狀細胞癌12例，臨床分期：Ⅰ期：5例，Ⅱ期：23例，Ⅲ期：8例，Ⅳa期：4例。淋巴結：淋巴結轉移癌11例，無淋巴結轉移癌29例。治療方式：實驗組和對照組所有患者均采取住院手術治療，術前均未接受放療、化療和生物治療。組織學分級依據2004年WHO分級標準。臨床分期依據FIGO 分期標準［7］。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要試劑：RhoA單克隆抗體，鼠抗人濃縮液（1 mg/mL）純化抗體購自香港abcam公司。DAB顯色試劑盒，PBS緩沖液粉劑，檸檬酸組織抗原修復液粉劑，多聚賴氨酸均購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.2.2 方法

1.2.2.1 載玻片、蓋玻片及組織切片的處理：載玻片放入30%鹽酸乙醇清潔液中浸泡24 h，流水沖洗，蒸餾水清洗3遍后浸泡于95%乙醇中6～8 h，晾干；稀釋的多聚賴氨酸溶液涂片，60℃烤箱烘干后裝盒備用。蓋玻片以30%鹽酸乙醇浸泡24 h，蒸餾水沖洗3次，無水乙醇沖洗1次，晾干備用。所有石蠟標本組織均4 μm層厚連續切片2張，撈片置于經賴氨酸處理過的載玻片上，65℃烘烤30 min，使組織緊貼于載玻片上，防止脫片。

1.2.2.2 免疫組化染色：免疫組化Supervision二步法［9］。

1.2.2.3 操作步驟：（1）組織切片常規二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化；PBS洗3次；（2）置檸檬酸鹽緩沖液中進行高溫高壓抗原修復：（3）取一定量pH6.0檸檬酸鹽緩沖液1 000 mL于壓力鍋中，大火加熱直至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入己沸騰的緩沖液中，緩沖液沒過切片，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續加熱至噴氣，從噴氣開始計時，5 min后壓力鍋離開熱源；室溫冷卻，取出玻片，先用蒸餾水沖洗2次，放入3%甲醇過氧化氫浸泡 10 min，之后用 PBS 洗 2 次，每次 3 min；（4）切片組織用免疫組化油筆劃圈，防止抗體流散，分別滴加一抗；（5）PBS 洗后滴加二抗，室溫放置 20 min；（6）PBS洗后DAB顯色3～5 min；（7）流水沖洗，蘇木素復染；（8）1%鹽酸乙醇分化，水洗，PBS 返藍；（9）95%乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片；（10）光學顯微鏡觀察、拍照。（11）免疫組化染色陰性對照：用PBS代替一抗。

1.2.2.4 結果判定：免疫組化半定量［8］：RhoA陽性表達定位于細胞質。結果判斷由2位經驗豐富但不知受檢病例任何臨床和病理資料的病理科專業醫師，對免疫組化切片進行雙盲評估。每張切片選5個高倍視野，每個視野計數100個細胞，觀察腫瘤細胞免疫組織化學染色的情況。評分方法如下：（1）根據細胞染色強弱（記為a）：無著色為0分，淺黃或淺褐色為1分，棕黃或褐色為2分，深褐色為3分。（2）根據陽性細胞百分比（記為b）：1%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%～100%為4分。（3）a與b乘積為IHS評分：0為（-），1～4分為（＋），5～8 分為（＋＋），9～12 分為（＋＋＋）。統計分析時：記（-）為陰性，（＋）至（＋＋＋）為陽性。1.3 統計學分析

所有數據均用SPSS 13.0軟件包進行統計分析。用χ2檢驗等分析法分析RhoA蛋白表達與VSCC患者臨床病理因素之間的關系；P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 VSCC組織中RhoA蛋白的表達情況

RhoA陽性表達定位在細胞胞質內呈細小顆粒狀，RhoA在正常外陰皮膚中無表達，對照組VINⅡ陽性表達率10%（圖1，2）。實驗組40例中有31例陽性表達，陽性表達率77.5%，與對照組比較差異有統計學意義（P<0.01），圖 3，表 1。

2.2 RhoA蛋白與外陰鱗癌臨床病理因素的關系

高分化和低分化VSCC組中RhoA蛋白的陽性100%和68.96%，2組比較差異具有統計學意義（表2）。RhoA陽性表達隨著臨床分期增加而有增強趨勢（圖4），有淋巴結轉移的較無淋巴結轉移表達的有所增強（圖5）。表達率分別為72%和86%，2組比較差異無統計學意義。Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期VSCC組織中RhoA蛋白陽性表達率分別為 20%、78.2%、100%和100%，其中Ⅰ期分別與Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期比較，差異具有統計學意義。Ⅱ期分別與Ⅲ期和Ⅳ期差異無統計學意義，Ⅲ期和Ⅳ期比較差異無統計學意義。有、無淋巴結轉移組RhoA蛋白陽性表達率分別為

表1 RhoA蛋白在VSCC組織中表達情況Tab.1 Expression rate of Rhoa protein in VSCC tissue

3 討論

VSCC占外陰惡性腫瘤的80%～90%，多見于60歲以上婦女。VSCC直接浸潤和轉移較為常見，有淋巴結轉移者手術治愈率僅為30%～40%，預后較差。為防止腫瘤復發、轉移，尋求反應VSCC侵襲和轉移標記物，是目前該研究領域重要課題之一［8］。

腫瘤的侵襲和轉移是一個復雜多步驟過程，已有研究表明細胞因子間的信號轉導起重要作用，RhoA是一種小分子GTP結合蛋白，無活性狀態時與GDP結合位于細胞質中，受到細胞外刺激時，GDP轉變為GTP，RhoA獲得活性、轉位于細胞膜上而發揮細胞內信號轉導作用，活化的RhoA作用于下游效應蛋白 Rho 相關激酶［2，3］。

表2 RhoA表達與外陰鱗癌各臨床病理因素之間的關系Tab.2 Relationship between the expression of RhoA protein and clinical pathologic factors

Rho家族蛋白與腫瘤的發生發展多種因素有關，包括腫瘤生長增殖、侵襲和轉移，細胞凋亡，腫瘤新生血管生成等［9］。RhoA蛋白是Rho家族成員之一，近年研究發現RhoA在鼻咽癌、肺癌、乳腺癌、胃癌，結直腸癌、肝癌等多種腫瘤組織中表達并與疾病發生發展有關［10］。理論已闡明RhoA在腫瘤浸潤轉移中的作用機制：（1）通過Rho/ROCK活化信號傳導通路增強肌動蛋白-肌球蛋白的收縮力，肌動蛋白細胞骨架重組，增強腫瘤細胞運動能力。（2）調節細胞間或細胞與基質間黏附性，促進基質降解。

本研究結果顯示RhoA蛋白在VSCC組織中陽性表達明顯高于VIN II和正常外陰皮膚組織，2組比較有顯著性統計學意義（P<0.01），與林英姿等［11］卵巢癌的研究結果有相似性，提示RhoA蛋白參與了VSCC的發生。本研究結果顯示隨臨床分期的增高RhoA蛋白表達增強（Ⅲ期和Ⅳ期RhoA蛋白的表達明顯高于Ⅰ期、Ⅱ期），差異具有統計學意義；在有淋巴結轉移組的Rhoa蛋白表達明顯高于無淋巴結轉移組，差異有顯著性統計學意義（P<0.05），此結果與顧穎等［12］在子宮頸鱗癌中的研究結果相似，提示Rhoa蛋白在VSCC發展，浸潤及轉移過程中過度表達。

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