MODS技術的研究和應用進展

黃自坤，李俊明

（南昌大學第一附屬醫院 檢驗科，江西 南昌330006）

早期發現和診斷結核?。═uberculosis，TB）病人、及時選用敏感藥物給予有效治療，是減少TB傳播機會、控制TB疫情的關鍵環節。目前，病原學診斷仍是TB診斷的金標準，也是判斷疾病活動性、傳染性和療效考核的主要指標。傳統的TB病原學檢查主要是涂片抗酸染色檢查和羅氏培養基培養法（L－J法）。抗酸染色的優點是操作簡單，快速，但敏感性差，陽性率僅為30－40%。L－J法敏感性較好，但由于結核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）生長緩慢，檢測時間要求很長（一般為4周），加上藥敏分析的時間，報告周期一般需要2個月左右，很難滿足臨床需要［1］。

MTB全自動培養系統的出現是TB診斷的一個巨大進步，不僅使得MTB培養的敏感性獲得了很大的提高，培養的時間也明顯縮短［2］。但該方法只在一些發達國家得到了一定的應用，而全球TB患者絕大部分分布在經濟相對落后的發展中國家。因此，研發快速、可靠、適于在發展中國家推廣的TB診斷和藥敏檢測技術仍是包括我國在內的廣大發展中國家急待解決的主要問題之一。

顯微鏡觀察藥敏檢測技術（microscopic observation drug－susceptibility assay，MODS）是近年來建立的一種結核病病原學檢測新技術，與傳統病原學檢測方法相比，具有敏感性好、檢出時間短、可同時進行藥敏分析、無需昂貴的特殊設備和檢測成本低等優點，被認為是一種適于在發展中國家推廣使用的TB診斷和藥物敏感性檢測方法，受到越來越多的關注。近年，MODS技術的研究和應用取得了很大的進展，本文就MODS技術的研究和應用進展，以及目前面臨的挑戰作一綜述。

1 MODS技術的原理及主要特點

MODS技術的主要原理是利用MTB在適宜的液體培養基中的生長速度較在固體培養基上快，且會形成特征性的索狀結構的特性，利用液體培養基對痰、胸水或腦脊液等標本進行直接培養，并在一定時間內在顯微鏡下觀察是否形成特征性索狀結構，以判斷標本中是否存在MTB的方法。MODS技術一般采用24孔細胞培養板進行MTB的培養，培養至一定時間后定期在倒置顯微鏡下觀察MTB生長形成的特征性索狀結構。若在培養時設置加有一定濃度抗結核藥物的培養孔，對比含和不含藥物的培養孔內MTB的生長情況，即可對待檢MTB的藥物敏感性進行評價［3］。

目前，MODS技術一般采用含10%OADC添加劑的M7H9液體培養基進行MTB培養，陽性標本一般可在7天左右觀察到特征性的索狀結構。同時，由于MODS技術可直接對臨床標本進行培養以獲得其中MTB的藥物敏感性信息，而不像傳統的藥敏檢測方法那樣需要利用MTB純培養物進行分析，因此與傳統病原學診斷方法相比，其檢測時間大大縮短。此外，MODS技術還具有遠高于傳統病原學診斷方法的敏感性，以及遠低于MTB全自動培養方法的成本的特點。因此這一技術的實施和推廣將對目前結核病的診斷和藥敏檢測產生巨大的推動作用。

2 MODS技術在結核病診斷中的研究和應用

2.1 MODS技術在肺結核診斷中的研究和應用

MODS技術由Caviedes等［3］在2000年首先報道。在該項研究中，Caviedes等系統比較了金胺O染色法、L－J法、7H11培養基培養法、分枝桿菌自動化培養系統、MODS技術和PCR技術對臨床疑似結核病患者的痰標本的檢測參數，結果顯示，MODS技術的敏感性達到92%，顯著高于金胺O染色法和固體培養基培養法（L－J法和7H11培養基培養法），與分枝桿菌自動化培養系統和PCR技術無顯著性差異。同時，在所有的病原學檢測方法中，MODS技術的檢出時間最短（9天），且檢測成本僅為分枝桿菌自動化培養系統檢測成本的約十分之一。因此這一研究充分展示了MODS技術在結核病快速診斷中的價值。

隨后，Moore等［4］開展的一系列大樣本多中心的研究結果顯示，MODS技術診斷結核病的陽性預測值和陰性預測值分別為97.0%和99.7%，而平均檢出時間僅為6－8天，明顯短于分枝桿菌自動化培養系統的10－16天和L－J法的21－33天，進一步肯定了MODS技術在結核病診斷中的重要價值。最近，不同學者分別在巴西、洪都拉斯、埃塞俄比亞、印度和厄瓜多爾等國家進行了MODS技術的應用研究，這些研究雖然在數據上有一些小的差異，但研究結果均支持MODS技術是一種敏感、可靠、快速和相對廉價的結核病病原學診斷技術，尤其適應于在經濟相對落后的發展中國家推廣應用［5－8］。

值得一提的是，Reddy和 Ha等［9，10］的研究顯示，對于HIV感染合并結核病的這一類特殊人群的診斷，MODS技術同樣具有很高的檢測敏感性和特異性，同時能夠滿足快速診斷的要求。這些研究提示MODS技術可以作為一種在HIV感染者中診斷或排除肺結核有效的篩選方法，對于在HIV感染者中進行結核病預防性治療措施的實施有重要的推動作用。

在國內，近期也有學者開展了一些MODS技術研究的有益探索，并取得了一些有價值的成果，但遺憾的是我國學者目前開展的研究多數是在實驗室以分枝桿菌標準株進行的研究，尚未見有直接采用臨床標本進行檢測的研究報道［11－13］。

2.2 MODS技術在兒童結核病診斷中的研究和應用

由于痰標本留取困難等原因，兒童肺結核的病原學檢測往往檢出率很低，加之兒童結核病往往癥狀不典型，很容易造成漏診和誤診。為提高兒童肺結核的診斷率，很多學者嘗試采用其它的標本進行病原學檢測，如鼻咽抽吸物、胃抽吸物和糞便等，但這些標本成份較痰標本更為復雜，且MTB所處的環境與痰中也有很大的區別。為驗證MODS技術在這些標本中的診斷效能，探討其在兒童結核病中的應用價值，Oberhelman等［14］分別采用抗酸染色法、MODS技術和L－J法對165例患兒留取的胃抽吸物、鼻咽抽吸物和糞便標本進行檢測，結果表明，MODS技術的平均檢出時間為10天，檢測敏感性為86.8%，遠高于L－J法的55.3%和抗酸染色法的39.5%。尤其值得一提的是，在抗酸染色陰性的患兒標本中，MODS技術的檢測敏感性依然達到了82.6%。因此，該研究提示MODS技術同樣適用于胃抽吸物、鼻咽抽吸物和糞便等標本的快速、高效檢測。

最近，Ha、Oberhelman等［15，16］的一系列研究進一步肯定了MODS技術在兒童結核病診斷中的巨大優勢，證實MODS技術可大大提高對兒童結核病的診斷效率。但另一方面，Graham等［17］的研究同時發現，在結核病高危組中，一些兒童雖然有明顯的肺結核臨床癥狀，但MODS檢測結果卻為陰性，且具體原因還不清楚，仍需進一步深入探討。

2.3 MODS技術在肺外結核診斷中的研究和應用

肺外結核往往缺乏特異性的全身癥狀和影像學變化，局部癥狀也往往被其他癥狀掩蓋，因此臨床診斷較為困難，實驗室診斷顯得尤為重要。但常規方法如涂片鏡檢和固體培養基培養法等在肺外結核的診斷方面效果并不理想，因此尋找一種更為敏感和特異的肺外結核檢測方法一直是臨床醫生和實驗室研究人員的努力方向。Caws等［18］最先探討了MODS技術在結核性腦膜炎中的診斷價值。在該研究中Caws等對230份臨床疑似結核病腦膜炎患者的腦脊液標本進行了檢測，結果顯示MODS檢測的敏感性為64.9%，顯著高于抗酸染色法的52.6%，與分枝桿菌全自動培養系統和L－J法（均為70.2%）比較略低，但統計學分析顯示差異并無顯著性。Caws認為，該研究中MODS法敏感性稍差的主要原因可能在于檢測過程中標本使用量上的差異。在MODS檢測中，由于細胞培養板容量的限制，每檢測孔的標本量只有100μl，而分枝桿菌全自動培養系統和L－J法接種的標本均為250μl，而病原學檢測的敏感性與標本量的多少是直接相關的，若使用較大容量的培養板，其陽性率可能會進一步提高。此外，本研究的另一個有趣的發現是，與檢測痰標本的檢出時間相比，MODS檢測腦脊液的平均檢出時間更短，只需6天，這可能由于腦脊液標本無需進行前處理即可直接進行培養，而痰標本在培養前需經氫氧化鈉和乙酰半胱氨酸進行預處理，而這種預處理可能對MTB的生長具有抑制作用。因此，這一研究提示MODS在結核性腦膜炎診斷中不僅具有有敏感、快速的特點，還具有操作簡便和費用低廉的優點，對結核性腦膜炎的早期診斷具有重要價值。

此后，Tovar等［19］探討了MODS技術在結核性胸膜炎中的診斷價值。研究發現，在對胸膜活檢組織的檢測中，MODS的敏感性達到81%，遠高于L－J法的51%。雖然在胸水中的檢測敏感性只有20%－40%（視標本的處理與否不同），但也遠高于L－J法的6%－7%。同時，與在其他標本中一樣，MODS的平均檢出時間與L－J法相比有很大的縮短，顯示MODS技術對結核性胸膜炎的診斷也具有很好的應用和推廣價值。

3 MODS技術在MTB藥敏檢測中的研究和應用

耐藥MTB的產生和流行是結核病化療的巨大障礙。研究證實，由于經驗性治療的不合理用藥是耐藥性MTB產生的重要原因之一，反過來，隨著耐藥率的不斷升高，經驗性用藥的弊端更加明顯［20］。由于目前 WHO推薦的MABA法（microplate alamar blue assay）進行MTB的藥敏分析需要采用MTB純培養物進行檢測，所需時間很長，臨床往往無法等待藥敏檢測報告再作治療，因此這一矛盾在廣大的發展中國家仍難以克服，這也是目前耐藥性結核病逐年升高的主要原因之一。MODS技術由于可采用臨床原始標本直接進行藥物敏感性分析，且培養時間較短，在MTB的藥敏檢測中表現出良好的應用潛力。

Caviedes等最先評價了MODS技術在檢測MTB對利福平（RIF）和異煙肼（INH）耐藥性中的價值［3］。研究顯示，視采用的藥物濃度不同，MODS技術對RIF和INH的藥敏檢測結果與金標準MABA的符合性為89%－100%，表現出極佳的可靠性，更為重要的是，藥敏檢測時間由MABA的3周（尚未計算得到純培養物的標本培養時間）縮短至9.5天，大大縮短了藥敏檢測的時間，對臨床合理選用治療藥物具有重要的意義。隨后，Moore和Mello等［4，21］的研究均證實，MODS技術檢測 MTB對RIF和INH敏感性的結果與金標準方法的符合率均在90%以上，得到藥敏結果的中位時間由68天縮減到7天。這一系列的研究均提示MODS技術在分析MTB對RIF和INH的敏感性方面具有極佳的可靠性和推廣應用價值。但在對另幾種抗結核一線藥物如乙胺丁醇（EMB）和鏈霉素（SM）的藥敏檢測中，不同的實驗室得出的結論卻存在較大差異，Moore等［4］的研究顯示 MODS技術對EMB和SM的藥敏檢測結果與金標準方法的符合率均大于90%，但Caviedes等［3］的研究卻顯示只有51%－77%。這可能與不同研究小組采用的藥物來源和濃度不同，以及MTB在不同地區的耐藥譜存在差異有關。但大多數的研究均提示MODS技術對臨床常用的抗結核藥物的藥敏分析結果具有很高的可靠性［22－27］。Minion等［28］最近進行的一項薈萃分析也支持這一觀點。

4 MODS技術面臨的挑戰及展望

綜上所述，MODS技術與現有的結核病病原學診斷方法相比，具有不可比擬的優點，適合于在發展中國家大力推廣。但作為一種新興技術，MODS技術同樣存在一些不足，在推廣應用之前尚面臨一系列的挑戰。其中，首當其沖的是如何實現MODS技術的標準化。目前，雖然已有大量的相關研究報道，但不同研究小組對標本去污劑的選擇及去污處理方法、標本的最終接種量、藥敏檢測過程中的藥物濃度選擇等很多方面均缺乏統一，研究過程中采用的參照方法也各不相同，而這些差異都會直接影響到檢測結果。因此，建立一個統一的標準對更為客觀地評價MODS技術的效果，增強不同實驗室之間的結果可比性方面具有重要意義。其次，MODS技術與分枝桿菌全自動培養系統一樣，難以對培養出的細菌進行進一步的分類鑒定。再次，由于在檢測過程中需頻繁地取出培養板觀察，MODS技術的操作安全性也不容忽視。

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