氫氣預處理對乳鼠海馬神經元細胞缺氧／復氧損傷后細胞活力的影響

盧 欣

鄭州大學基礎醫學院 鄭州 450052

由于缺血再灌注或炎癥引起的氧自由基損傷是導致眾多疾病的原因之一。氫氣作為抗氧化劑可以選擇性地減少細胞內氧自由基，從而起到預防和治療疾病的作用。氫氣可以選擇性減少羥自由基，特別是活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），從而保護細胞。但氫氣并不直接與ROS反應，通入氫氣可以減輕和抑制氧應激造成的損傷程度。由于氫氣可以快速通過細胞膜，因此可作為高效的抗氧化劑，減少細胞內ROS的生成來減少氧損傷從而保護細胞［1］。本實驗用MTT法檢測氫氣預處理后的海馬神經元細胞活力，觀察氫氣對神經元細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級新生SD乳鼠（＜24h），由鄭州大學實驗動物中心提供，DMEM高糖培養基（美國Sigma公司），特級胎牛血清（美國Sigma公司），胰蛋白酶粉（美國Sigma公司），NSE染色試劑盒（美國Sigma公司），MTT試劑（美國Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 體外培養海馬神經元細胞：實驗步驟：用75%酒精消毒新生SD乳鼠（＜24h）8只，在超凈工作臺內斷頭取出顱腦，放入預冷的PBS緩沖液中，剝離兩側海馬，在體視顯微鏡下剔除被膜和血管，剪成0.5mm3大小的組織塊，加入0.25%胰蛋白酶10mL，37℃水浴消化15min，每間隔5min吹打混勻1次。加入等體積含10%FBS的DMEM培養液終止消化3min，加入3倍體積培養基吹打混勻，用2 000目尼龍網過濾細胞懸液。調整細胞密度，按2×105／mL接種于6孔培養板和9×104／mL接種于96孔培養板中，置入37℃、5%CO2培養箱中培養，隔日換液，取第5天細胞進行實驗。1.2.2 實驗分組：隨機分為3組，對照組：常規培養；缺氧／復氧組（H／R組）：細胞在100%N2中培養15min后放入37℃、5%CO2培養箱中培養30min，造成缺氧／復氧損傷；氫氣預處理組：細胞在2%H2＋98%N2中培養15min后放入37℃、5%CO2培養箱中培養30min。

1.2.3 神經元鑒定：將處理后6孔板中細胞用1：1的甲醇：丙酮固定30min，用預冷的PBS沖洗3遍后，按照進行NSE試劑盒說明書進行免疫化學染色，著色陽性為棕黃色。

1.2.4 細胞活力測定：將處理后96孔細胞培養板每孔加入MTT（5g／L）20μL和180μL無血清培養液，孵育4h后終止培養。盡可能吸凈每孔MTT液后，加入100μL二甲基亞砜（DMSO），震蕩10min，在酶聯儀595nm處測定吸光值（OD）。細胞活力（%）＝（實驗組OD／對照組OD）×100%。

1.3 統計學處理 應用SPSS 13.0軟件進行統計分析，數據以均數±標準差（±s）表示，采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

免疫化學染色顯示：對照組視野布滿棕黃色陽性細胞，細胞胞體不規則，神經突觸互相連接成網；缺氧／復氧組棕黃色陽性細胞數較少，細胞皺縮，神經突觸很少，氫氣預處理組棕黃色陽性細胞數比缺氧／復氧組多，仍能看到不規則的胞體形態，仍有連接的神經突觸。

細胞活力測定顯示：以對照組海馬神經元的細胞活力100%，缺氧／復氧組（39.8±2.41）%，氫氣預處理組（51.0± 1.94）%。與對照組比較，缺氧／復氧損傷使細胞活力大為降低（P＜0.05），而氫氣預處理組的細胞活力較缺氧／復氧組明顯升高（P＜0.05），說明氫氣能夠提高海馬神經元細胞的活力，減少缺氧／復氧損傷。

3 討論

氫氣是一種雙原子氣體，密度小于空氣，在一些化學反應中有一定的還原性，被認為是惰性氣體。Downey等［2］的研究表明，氫氣（hydrogen，H2）可能是除了一氧化碳（carbon monoxide，CO）、硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）和一氧化氮（nitric oxide，NO）的第四類氣體類的信號分子（gasotransmitter），在某些情況下可以參與機體的抗氧化過程［3］。Maier等［4－6］的研究表明，大鼠吸入2%氫氣可顯著減輕腦缺氧／復氧損傷，說明氫氣是一種比較理想的細胞保護劑。這是由于氫氣是一種較小的生物活性分子，透過細胞膜的速度較快，又易于進入線粒體。雖然氫氣不直接和氧自由基反應，但可作為高效的抗氧化劑，選擇性地減少ROS［7］。

本實驗通過體外培養海馬神經元細胞，制造缺氧／復氧損傷模型，采用免疫化學鑒定和MTT法初步探討了氫氣對海馬神經元細胞缺氧／復氧損傷的保護作用。該實驗結果表明氫氣預處理可增加細胞活力，從而對離體的海馬神經元細胞缺氧／復氧損傷起到保護作用。

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［2］ 胡文忠，王曉強.一氧化氮與一氧化氮合酶抑制劑對腦缺血后海馬神經元的保護作用［J］.中國實用神經疾病雜志，2011，14（3）：8－9.

［3］ Downey JM，Cohen MV.A really radical observation－a comment on pennaet［J］.Basic Res Cardiol，2006，101：190－191.

［4］ Maier RJ.Availability and use of molecular hydrogen as an energy substrate for Helicobacter species［J］.Microbes Infect，2003，5（12）：1 159－1 163.

［5］ 孫學軍，Zhang JH.氫——一種內源性抗氧化劑［J］.第二軍醫大學學報，2008，29（3）：233－235.

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［7］ Fukuda K，Asoh S，Ishikawa M，et al.Inhalation of hydrogen gas suppresses hepatic injury caused by ischemia／reperfusion through reducing oxidrative stress［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，36：670－674.