大鼠腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞與突觸可塑性的關(guān)系

郭 濤 王新華 石 磊 陳寧寧 趙源征 張 敏 劉恒方

鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052

神經(jīng)生長相關(guān)蛋白（growth associated protein，GAP－43）是決定神經(jīng)元發(fā)育和再塑的內(nèi)在因素，在神經(jīng)損傷情況下表達(dá)常顯著增加，故將其作為特異性分子探針用于神經(jīng)修復(fù)研究。星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocyte，AS）在腦組織缺血時最易受損。膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）作為AS數(shù)量變化的指標(biāo)和特異性診斷物。本實(shí)驗(yàn)通過觀察在缺血再灌注狀態(tài)下神經(jīng)突觸可塑性變化與AS反應(yīng)的動態(tài)關(guān)系，探索通過干預(yù)AS幫助神經(jīng)突觸形成，對臨床治療腦缺血再灌注損傷具有實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 動物實(shí)驗(yàn)分組 甄選72只10～12個月的SD雄性健康大鼠，體質(zhì)量300～400g（河南實(shí)驗(yàn)動物中心提供），隨機(jī)分成缺血再灌注組和對照組各36只。對照組實(shí)驗(yàn)開始后12 h、1d、3d、7d、14d、21d分別處死6只。缺血再灌注組再分為腦缺血2h再灌注12h組、1d組、3d組、7d組、14d組，每組6只。

1.2 模型的制作 局灶性腦缺血再灌注模型制作采用常規(guī)線栓法。左側(cè)大腦中動脈（middle cerebral artery，MCA）被插入線拴。自CCA分叉處開始栓線長18～20mm。線栓于缺血2h后抽出，即再灌注形成。不插入線拴即假手術(shù)對照，模型成功標(biāo)志為線拴插入后出現(xiàn)左側(cè)Horner征，大鼠清醒后出現(xiàn)右側(cè)肢體偏癱，Longa評分1～3分。

1.3 切片及取材制備 在相應(yīng)時間點(diǎn)麻醉動物，分別取出心臟、大腦，固定，石蠟包埋。自海馬開始連續(xù)冠狀切片。HE染色選取7d缺血再灌注和對照組，每例樣本均做GAP－43、GFAP組織免疫化學(xué)染色。

1.4 指標(biāo) （1）HE染色：光學(xué)顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)病理變化；（2）GAP－43、GFAP組織免疫化學(xué)染色：GAP－43兔多克隆抗體購自（Santa Cruz Biotechnology，Inc.USA）。GFAP兔多克隆抗體、二抗試劑盒SP9001抗兔均購自Vector Laboratories公司；GFAP、GAP－43陽性細(xì)胞胞漿或胞核被染成棕黃色。各切片在海馬CA1區(qū)隨機(jī)計(jì)數(shù)5個高倍視野（400×），測其積分光密度，取平均值，即為該切片平均積分光密度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，多個樣本均數(shù)間比較用單因素方差分析（one－way ANOVA），檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 灌注后表現(xiàn) 大鼠灌注后反應(yīng)遲鈍，精神萎靡，進(jìn)食減少，1d后假手術(shù)組反應(yīng)靈敏，精神恢復(fù)，進(jìn)食增多。

2.2 HE染色 對照組神經(jīng)元細(xì)胞變性、死亡少見，細(xì)胞形態(tài)基本正常，手術(shù)組白質(zhì)內(nèi)可見散發(fā)性神經(jīng)纖維及髓鞘變性，神經(jīng)元細(xì)胞很多變性、壞死，核濃縮，空泡變性。

2.3 GFAP、GAP－43的表達(dá) （1）缺血再灌注組：GFAP陽性細(xì)胞3d后開始增加，7d后GFAP的反應(yīng)至高峰，14～21 d后反應(yīng)回落；GAP－43在12h表達(dá)升高，7d達(dá)到峰值，14d回落，21d表達(dá)稀少。（2）對照組：各指標(biāo)變化規(guī)律與缺血再灌注組大致一樣，表達(dá)較缺血再灌注組均低（P＜0.01）。

2.4 相關(guān)性分析 （1）缺血再灌注組：GFAP與GAP－43相關(guān)系數(shù)r＝0.911，P＝0.011＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示二者高度相關(guān)。（2）假手術(shù)組：GFAP與GAP－43相關(guān)系數(shù)r＝0.656，P＝0.158＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

本研究中，手術(shù)組海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起變粗、胞體變大，GFAP陽性細(xì)胞數(shù)增加，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示腦缺血－再灌注后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增生，且增生持久，對照組GFAP陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少。

研究顯示僅在已分化定型且軸突生長的神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)GAP－43的存在，且與神經(jīng)元的胚胎起源無關(guān)，提示新生神經(jīng)元的軸突生長、發(fā)育與GAP－43無相關(guān)性。一旦開始分化，GAP－43會大量出現(xiàn)在大鼠的胞體和初生突起中，提示GAP－43與神經(jīng)發(fā)育密切相關(guān)。

星形膠質(zhì)細(xì)胞可分泌Glial因子影響突觸可塑性。Mauch等［1］發(fā)現(xiàn)，Glial因子是膽固醇與載脂蛋白E（ApoE）的復(fù)合體。膽固醇可通過增強(qiáng)突觸素（synapsin）和突觸泡膜素（synaptophysin）的生成，促進(jìn)突觸形成。有研究指出［2］，Glial釋放的TNF－α可通過加快AMPA受體的表面表達(dá)提高突觸效能。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的膽固醇源自星形膠質(zhì)細(xì)胞中的原位合成膽固醇，為突觸的生成提供原料，所以中樞神經(jīng)系統(tǒng)中膽固醇攝取、運(yùn)輸或生成過程中每一環(huán)的功能缺失均可能損傷突觸的發(fā)育和可塑性，故體內(nèi)膽固醇或脂蛋白缺失或供應(yīng)障礙，可出現(xiàn)神經(jīng)行為異常［3］。

綜上所述，GAP－43表達(dá)與星形膠質(zhì)細(xì)胞密切相關(guān)。可通過干預(yù)星形膠質(zhì)細(xì)胞加速神經(jīng)突觸形成，為臨床治療缺血性腦血管病提供新的思路。

［1］ Mauch DH，Nagler K，Sc humacher S，et al.CNS synaptogenesis promoted by gila－derived cholestero1［J］.Science，2001， 294：1 354－1 357.

［2］ Biattie EC，Stellwagen D，Morishita W，et al.Control of synaptic strength by glial TNF－α［J］.Science，2002，295：2 282－2 285.

［3］ 耿戰(zhàn)輝，程義勇.重新認(rèn)識神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞［J］.生理科學(xué)進(jìn)展，2003，34（3）：232.