蛋白質分離純化方法研究進展

吳少輝，劉光明

（大理學院藥學院，云南 大理 671000）

蛋白質在細胞和生物體的生命活動過程中（包括催化代謝反應、物質運轉、興奮的傳導、生長發育的控制等）起著重要的作用，因此，蛋白質是生命科學極為重要的研究對象。蛋白質的分離純化是蛋白質研究中不可缺少的環節，只有了解蛋白質的分子量、溶解性、等電點以及穩定性等基本性質，才能達到有效分離。

1 基于分子大小差異的分離技術

1.1 凝膠層析

凝膠層析又稱為凝膠過濾、分子篩層析或排阻層析，是利用凝膠的網狀結構，根據分子大小差異分離混合物的方法。由于該法上樣量有限，常用在純化的最后一步，并與其他分離方法（如離子交換[1]）組合使用。分離過程中，在保證原有生物活性的基礎上考慮裝柱、流速、洗脫液的選擇以及其他影響因素，最終確定合適的分離條件[2]。張及祿等[3]采用葡聚糖凝膠50（Sephadex G－50）等層析材料從白山巖棲蝮蛇蛇毒中分離純化出小分子多肽Saxis。張勇等[4]通過凝膠層析分離家蠅幼蟲血淋巴，得到了對真菌有抑制作用的組分。羅輕蕾等[5]通過硫酸銨沉淀和Sephadex G－200凝膠層析結合的方法，分離純化出美國紅魚血清免疫球蛋白。

1.2 超濾

超濾法是利用加壓膜分離技術，在一定的壓力下，使小分子溶質和溶劑穿過一定孔徑的特制薄膜，大分子溶質滯留，從而使大分子物質得到部分的純化。該法操作簡便、成本低廉、試驗條件溫和，不需加熱，與蒸發、冰凍干燥相比沒有相變化、pH變化，因而可以防止生物活性物質的變性、失活和自溶[6]。張秀媛等[7]研究了超濾法分離純化酪蛋白糖巨肽（CGMP）的條件，得到的最佳條件是在室溫下，壓差為0.02MPa，濃縮比為8。

1.3 透析

透析是利用小分子經過半透膜擴散到水（或緩沖液）的原理，將無機鹽等小分子與生物大分子分開的一種分離純化技術，常和鹽析、鹽溶等方法聯合使用。肖桂秀[8]通過凝膠色譜法、透析法和乙醇沉淀法對羚羊角塞水提液中的蛋白質、氨基酸等進行分離，透析結果表明，大的蛋白質分子和小的氨基酸分子得到初步分離。李任強等[9]根據蚯蚓體內血紅蛋白分子結構的特性與分布狀態，采用了雙水相萃取等工藝，分離純化了生物態含鐵蛋白質，獲得了高純度的蚯蚓含鐵蛋白。

2 基于溶解度差異的分離純化技術

2.1 等電點法

等電點沉淀法是利用蛋白質在等電點時溶解度最低且各種蛋白質等電點不同的特點進行分離的方法。徐律等[10]利用等電點法在魚糜漂洗水中提取魚蛋白，提取率達83.33％，該法具有操作簡單，提取率高等優點。陳申如等[11]用酸法提取鰱魚魚肉蛋白質，最適pH為2.39，該方法提取的鰱魚肉蛋白質無腥味，色澤潔白，產率高。

2.2 溶劑法

溶劑提取法包括水溶液提取法和有機溶劑提取法，其中緩沖溶液對蛋白質的溶解度大、穩定性好，最為常用；而乙醇、丁醇和丙酮等有機溶劑具有一定的親水性和較強的親脂性，主要用于一些脂質結合較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶。其中乙醇提取法溶解性能較好、溶出的水溶性雜質少、可回收反復利用。丁醇在一些與脂質結合緊密的蛋白質和酶提取中更加優越，溶解脂的能力強，兼具親水性，在溶解度范圍內不會引起酶的變性失活[12]。

2.3 雙水相萃取法

雙水相萃取技術是一種新型的分離技術。它把兩種聚合物與一種鹽的水溶液混合在一起，由于聚合物與聚合物之間或聚合物與鹽之間的不溶性形成兩相，與傳統的分離技術相比，具有操作條件溫和、處理量大、易連續操作等優點，同時克服了常規萃取有機溶劑對生物物質的變性作用，在粗提過程中保持了生物物質的活性及構象等優勢[13－14]。該技術現已成功地應用于分離蛋白質、抗生素微生物離子、電泳分離氨基酸等。采用雙水相系統濃縮目的蛋白，受聚合物分子量及濃度、溶液pH、離子強度、鹽類型及濃度的影響[15]。劉楊等[16]以聚乙二醇（PEG）/硫酸鈉雙水相體系，經一次萃取，從鈍頂螺旋藻（Spirulinaplatensis）細胞破碎液中富集分離得到藻藍蛋白。

反膠團萃取是指膠團內可溶解少量水而形成微型水池，利用膠團對外界有機溶劑的屏蔽作用，實現生物物質的溶解和分離。該技術具有選擇性高、萃取過程簡單，正萃、反萃同時進行，能有效防止大分子失活、變性。其不足之處包括：普通離子型表面活性劑可能對產品產生污染；常用的離子型表面活性劑容易造成蛋白質的變性和失活，雖然活性損失較少[17－18]。其影響因素主要包括表面活性劑種類以及濃度、離子強度、助表面活性劑、水相pH和溫度等[19]。反膠團萃取法還可提取蛋白質、酶、核酸、氨基酸和多肽。劉俊果等[20]利用反膠團萃取技術分離純化了新型溶栓藥物納豆激酶。

2.4 鹽溶法及鹽析法

許多蛋白質在純水或低鹽溶液中溶解度較低，若稍加一些無機鹽則溶解度增加，該現象稱為鹽溶；而當鹽濃度繼續增加時，蛋白質又會自動析出，該現象稱為鹽析。鹽溶和鹽析主要是通過影響蛋白質分子表面的電荷而分離、純化蛋白質。黃雄偉[21]報道，提取黃粉蟲蛋白質的最佳工藝條件是氯化鈉0.5％，提取溫度50℃，液固比8∶1（體積質量比），提取時間3h，蛋白質沉淀pH=4.8。

鹽析法是粗分離蛋白質的重要方法之一，常用硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉和硫酸銨等中性鹽。硫酸鈉具有化學性質穩定、溶解度大等優點，現在所指的鹽析法實際上多為硫酸銨鹽析法。該法受蛋白質濃度、離子強度、鹽的性質、pH及溫度等因素影響。李媛等[22]在家蠶絲素RGD融合蛋白的鹽析純化工藝研究中，得到的最優純化條件為pH=8，硫酸銨在溶液中的飽和度為20％，室溫。

上述兩種方法分離純化蛋白質后，都要采用凝膠過濾或透析除鹽[22]。

3 基于電荷不同的分離技術

3.1 離子交換層析

離子交換層析是發展最早的層析技術之一，目前已成為蛋白質分離純化最常用的手段。離子交換層析以纖維素或交聯葡聚糖凝膠等物質的衍生物為載體，在某一pH條件下，這些載體帶有正電荷或負電荷，當待分離蛋白質分子通過載體時，離子交換使蛋白質分子分離純化。胡鵬等[23]通過DEAE－Sepharose－FF瓊脂糖凝膠離子交換層析法，對牛背最長肌中鈣激活酶進行了分離純化，并確定了最佳分離條件。

3.2 電泳技術

電泳技術作為分離純化蛋白質的手段之一，無論是單向凝膠電泳還是雙向凝膠電泳，都是分離度極高的分離方法，可分為變性電泳、常規電泳、等電聚焦電泳和毛細管電泳。獲得分離的蛋白質，均可用電洗脫或電轉印到硝酸纖維素膜上直接進行序列分析。吳序櫟等[24]通過十二烷基硫酸鈉 －聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分離雞蛋的蛋白質組分，采用免疫印跡方法鑒定過敏原，通過離子交換層析對雞蛋主要過敏原進行了初步純化。

4 基于對配體親和力差異的分離技術

親和層析是一種以樣品的生物活性為依據的分離技術。分析膜蛋白方法是利用蛋白質能和某些專一分子可逆結合的特性而發展起來的層析技術。當蛋白質溶液通過層析柱時，其中可與親和載體配基相互作用的受體被吸附劑結合，不被吸附的無關成分則可隨流出液通過柱體，從而將吸附蛋白與其他蛋白質分開，而后利用高濃度的底物溶液或親和力更強的底物衍生溶液洗脫目標蛋白，即可脫離層析柱上的載體。1983年Anastasi等[25]采用親和層析方法，首次在雞蛋清中分離得到了兩種不同 PI值（6.5和5.6）的蛋白質。

5 基于選擇性吸附差異的分離方法

疏水層析是利用固定相載體上偶聯的疏水性配基與流動相中的一些疏水分子發生可逆性結合的特性進行分離。在高鹽溶液中，蛋白質會與疏水配基相結合，其他的雜質蛋白則無此種性質，從而使蛋白質初步分離。該方法具有使蛋白質變性、僅適合部分蛋白質等缺點。吳銀飛等[26]采用疏水作用層析法純化小鼠腹水來源的抗乙肝核心抗原（HBeAg）單克隆抗體（mAb），并對分離條件進行了優化。

6 其他方法

反相高效液相色譜法是一種以疏水作用為基礎的色譜分離法，具有分辨率高、重復性好、回收率高等優點，在蛋白質及多肽的分離分析中得到了極其廣泛的應用。

分子印跡是一種識別聚合物特殊結合位點的技術。隨著分離蛋白質印跡聚合物的成功合成，蛋白質印跡技術已成為研究熱點。

高效毛細管電泳技術是20世紀80年代問世的一種高效液相分離技術，是經典電泳技術與現代微柱分離相結合的產物。目前，它已成為分析科學中最具活力的方法之一，因其分離效率高、分析速度快、樣品用量少、抗污染能力強和易自動化等特點，被廣泛應用于分子生物學、醫學、藥學以及高分子等多個領域。

作為蛋白質產品分離純化的主流技術，柱層析具有很高的分離效率，通常采用固定床間歇操作方式，操作簡單，但存在著載體利用率低和過程效率低的問題。

采用連續逆流操作層析，分離效率和產率均有提高，對于難分離體系，逆流層析過程是一種有效分離手段。

7 結語

到目前為止，還沒有單一的方法能夠分離、純化出高純度的蛋白質，應依據物理、化學以及生物學特性的不同，采用多種分離方法，以便在分離、純化的同時，更好地保持蛋白質的生物學性質。因此，蛋白質的分離、純化仍然是一項艱巨而繁重的任務。

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