重組人食管癌相關基因4蛋白的體外抑癌功能研究

李曉燕 高天慧 周云 王文玉 李林蔚

食管癌是一種嚴重危害我們人類健康的起源于消化道食管黏膜上皮的惡性腫瘤，而且食管癌的發病率和死亡率在世界上均排名惡性腫瘤的前列［1，2］。更為重要的是，中國歷年來是食管癌的高發地區，其中最主要的病理類型為食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)［3，4］。

人食管癌相關基因4(esophageal cancer related gene 4，ECRG4)是重要的食管癌相關的新基因［5，6］。我們發現，人食管癌相關基因4的基因表達的下降在食管鱗狀細胞癌的發生中具有非常重要的地位。目前，人食管癌相關基因4蛋白的生物學抑制腫瘤生長的功能還不清楚。我們的初期研究結果表明，人食管癌相關基因4是食管癌的候選抑癌基因，人食管癌相關基因4蛋白是食管癌預后的標志物。人食管癌相關基因4可以通過參與炎癥反應的中心通路，并且下調炎癥產物環氧化酶-2的表達來發揮其抑制腫瘤細胞生長的功能［7-9］。Mori等［10］研究進一步證實了我們的結論。

以往的研究表明，人食管癌相關基因4是腫瘤相關抑癌基因，人食管癌相關基因4的表達過量能夠抑制腫瘤細胞的生長增殖［7］。然而，關于人食管癌相關基因4蛋白的亞細胞定位和抗腫瘤增殖功能國內還未見報道。本實驗中，我們檢測人食管癌相關基因4蛋白的亞細胞定位，同時進一步研究純化的重組人食管癌相關基因4蛋白的體外抑癌功能，研究重組人食管癌相關基因4蛋白能否成為未來的食管癌的生物治療藥物。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑 我們采用人的食管癌細胞系EC9706和NEC，和動物的永生化細胞株HEK293。實驗細胞細胞培養利用含有10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的RPMI1640培養基，培養條件為37℃和5%CO2的飽和濕度培養箱。實驗用的DMEM培養液、胎牛血清、青霉素和鏈霉素等試劑都購買于美國Gibco公司。醫學科學院腫瘤研究所自己研制了抗人食管癌相關基因4蛋白的多克隆抗體［7］。羊抗兔 IgG購自 Santa Cruz公司。Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。

1.2 人食管癌相關基因4蛋白的亞細胞定位 1)內源性:將EC9706腫瘤細胞接種到準備好的培養皿中，等到腫瘤細胞生長到符合條件，采用即時準備的4%多聚甲醛固定腫瘤細胞10 min。PBS溶液沖洗三次。0.2%triton X-100細胞通透化處理10 min。PBS溶液沖洗三次。再利用即時準備的2%BSA封閉30 min。PBS溶液沖洗三次。然后我們再加入即時稀釋的抗人食管癌相關基因4蛋白的多克隆抗體，在溫箱中放置1 h。PBS洗三遍，5 min/次。加入熒光標記的二抗，室溫孵育45 min。PBS溶液沖洗三次。然后我們再加入即時準備的0.5 μg/ml的DAPI溶液染色15 min。PBS溶液沖洗三次。最后我們加入即時準備的20 μl封片劑封片，冰箱中備用。熒光照相裝置利用激光共聚焦顯微鏡拍照定位。DAPI(藍色)染細胞核。2)外源性:我們利用NEC腫瘤細胞轉染標記了綠色熒光蛋白的人食管癌相關基因4的基因質粒，表達出了伴隨有綠色熒光蛋白的人食管癌相關基因4蛋白。具體步驟為將EC9706腫瘤細胞接種到準備好的培養皿中，等到腫瘤細胞生長到符合條件，參照LipofectminTM2000試劑盒的說明分別轉染pEGFP-N1-ECRG4及空載質粒。2 d后扔掉腫瘤細胞培養基，PBS溶液沖洗三次，取出玻片，然后用4%的多聚甲醛固定腫瘤細胞30 min。PBS溶液沖洗三次，然后在玻片上加入一定的甘油緩沖液(將NaHCO33.7 g和Na2CO30.6 g溶于100 ml去離子水中，用NaOH調pH至9.5，加入等量的甘油，充分混合)，蓋在載玻片上，封片，防止氣泡產生。熒光照相裝置利用激光共聚焦顯微鏡拍照定位。

1.3 分泌蛋白的檢測 計數瞬轉后培養24 h的EC9706/pcDNA3.1和EC9706/pcDNA3.1-ECRG4細胞，然后我們扔掉腫瘤細胞培養基，然后腫瘤細胞離心15 min，然后我們用濾膜過濾腫瘤細胞培養液，濾過液Heto FD3(Heto-Holten，Denmark)濃縮。

1.4 MTT腫瘤細胞抑制實驗 將一定數量的EC9706腫瘤細胞接種到細胞培養板中，然后利用PBS溶液沖洗腫瘤細胞培養孔三次，然后我們用相應的濃度的重組人食管癌相關基因4蛋白溶液處理腫瘤細胞，并設立對照實驗組，腫瘤細胞再繼續培養48 h，檢測時我們每孔加入即時配制的MTT溶液15 μl，然后腫瘤細胞再培養4 h，最后我們扔掉腫瘤細胞培養液，每孔中再加入DMSO溶液150 μl，混勻溶液，最后我們利用酶標儀測定溶液吸光度值。

1.5 統計學方法 使用SPSS 11.0軟件進行實驗的統計分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人食管癌相關基因4蛋白的定位 1)內源性:利用免疫熒光染色的方法證實內源性表達的人食管癌相關基因4蛋白的定位是位于細胞中的細胞質部位。2)外源性:利用綠色熒光蛋白標記人食管癌相關基因4蛋白的方法證實，外源性表達的人食管癌相關基因4蛋白的定位也位于細胞中的細胞質部位。

2.2 人食管癌相關基因4蛋白是分泌性蛋白 利用Western blot的檢測方法證實，人食管癌相關基因4蛋白是分泌性蛋白。

2.3 重組人食管癌相關基因4蛋白體外抑制腫瘤細胞增殖

利用MTT檢測的方法證實，重組人食管癌相關基因4蛋白能夠在細胞培養液中抑制腫瘤細胞的生長增殖(P＜0.05)。

3 討論

人食管癌相關基因4是與食管癌發生發展相關的重要的新基因，因此研究人食管癌相關基因4蛋白的生物學功能將具有重要的意義。研究結果表明內源性和外源性人食管癌相關基因4蛋白都定位于細胞質。而生物信息學分析提示，組成人食管癌相關基因4蛋白的148個氨基酸中，1-31個氨基酸為信號肽，是重要的分泌性蛋白質。本研究中，我們利用Western blot的檢測方法證實，人食管癌相關基因4蛋白的確是分泌性蛋白質。而且，研究中我們進一步通過優化條件表達和純化出大量可溶性的重組人食管癌相關基因4蛋白。實驗結果表明，我們表達和純化的水溶性的重組人食管癌相關基因4蛋白具有體外抑制腫瘤細胞增殖的生物學功能活性，為進一步研究人食管癌相關基因4蛋白的晶體結構和獨特的抗腫瘤生物學功能創造了有利條件。

更重要的是，純化的水溶性重組人食管癌相關基因4蛋白可以作為食管癌的潛在治療藥物，值得進一步深入的進行體內抗癌作用和抗癌作用機理研究。我們的結果首次證明了人食管癌相關基因4蛋白是分泌蛋白。目前，我們正在進一步深入的研究人食管癌相關基因4蛋白的體內外抑癌功能和作用機理，闡明其在食管癌發生中的作用。

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