低氧對神經(jīng)干細胞增殖及分化的影響

杜 娟， 陳 立， 陳 麗綜述， 呂曉紅審校

神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)是近年來治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病頗具前景的基因工程細胞，尤其是在神經(jīng)功能修復方面，具有重要的科學意義及社會應用價值。對于神經(jīng)功能損傷的治療，目前僅限于內(nèi)科藥物治療及外科手術干預，但對于已經(jīng)喪失的神經(jīng)功能的恢復和重建，這些治療措施都無根本性療效。而神經(jīng)干細胞的研究和發(fā)展為解決這一問題提供了重要的途徑和手段，成為研究的熱點。但神經(jīng)干細胞移植目前仍處于動物實驗階段，究竟是什么制約這一研究的進展呢?眾所周知，神經(jīng)干細胞首先要在移植體內(nèi)存活，才能發(fā)揮作用。大量的動物實驗表明，在被移植入損傷區(qū)后，神經(jīng)干細胞的存活、增殖、分化以及遷徙過程均受到局部復雜微環(huán)境等因素的影響，特別是腦血管疾病中缺血缺氧的局部微環(huán)境，這是制約干細胞移植的瓶頸之一。隨著對這些問題認識的不斷深入和研究的不斷進展，到目前為止的證據(jù)表明干細胞療法的繼續(xù)發(fā)展，最終可能成為缺血性腦損傷可行的治療選擇。

1 氧濃度是神經(jīng)干細胞微環(huán)境中的重要組分

自我更新和多能性是干細胞的特性，而這種特性與干細胞所處環(huán)境中各種因素的平衡密切相關，該環(huán)境稱為微環(huán)境，早在1978年Schofield就提出了這一概念，即細胞、細胞間質(zhì)及影響細胞生長的各種因素組成的復雜而統(tǒng)一的環(huán)境，微環(huán)境中的任何因素發(fā)生變化，都會轉化成一定的信號進而影響細胞。其中包括傳統(tǒng)認識中的培養(yǎng)基成分、營養(yǎng)因子、pH、氧濃度等，特別是氧氣濃度成為一直以來研究的熱點，被認為是微環(huán)境中非常重要的因素。以往認為細胞生存所需氧濃度與大氣中氧濃度(21%，160mmHg)相同，但在生物體內(nèi)并非如此，氧氣從被吸入肺部然后隨血液運送至全身，到達器官和組織時其濃度和壓力已非常低(2% ～9%，14～65 mmHg)。近年來研究亦顯示，體內(nèi)多種組織特別是含有干細胞的組織中氧濃度遠遠低于大氣氧濃度，而微環(huán)境中的這種低氧狀態(tài)不管對胚胎干細胞還是成體干細胞的生物學行為影響都非常巨大［1］。如骨髓間充質(zhì)干細胞所處的微環(huán)境便是一種低氧環(huán)境，氧濃度約為1% ～7%。體外實驗表明，低氧可以使干細胞的細胞周期減慢，分化減少。1%氧濃度下較21%氧濃度下，間充質(zhì)干細胞發(fā)生了各方面的變化。細胞在形態(tài)上表現(xiàn)出體積增大;細胞的增殖明顯減少并且大部分停止在G1期［2］。另有研究表明，低氧在骨髓造血干細胞和間充質(zhì)干細胞的增殖和成熟過程中起重要作用。且低氧持續(xù)時間是細胞分化潛能的一個鑒定指標。在更接近于生理條件的缺氧環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)的研究顯示，與常氧濃度下培養(yǎng)相比，在5%氧濃度下，細胞的分化減少，其干細胞特性保持的更強，這可能暗示體內(nèi)的低氧環(huán)境可以使更多的干細胞處于靜息狀態(tài)［3］。對于神經(jīng)母細胞瘤細胞，間歇性低氧可以增強其類似干細胞的特性，并抑制其分化傾向，這似乎從另一方面證明了氧濃度對干細胞的作用［4］。

神經(jīng)干細胞是干細胞的一種，具有自我更新、增殖及分化成星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元的能力。在成體，神經(jīng)干細胞主要存在于側腦室室管膜下層(subventricular zone，SVZ)和海馬齒狀回顆粒下層(subgranular zone，SGZ)，這是目前公認的兩個神經(jīng)發(fā)生區(qū)域。有研究顯示小鼠的腦組織中氧分壓亦遠低于大氣，中腦處約為0.55%，大腦皮質(zhì)處約為8%，神經(jīng)干細胞亦處于一種相對低氧的特殊微環(huán)境中，推測該微環(huán)境中氧濃度約為2.5% ～3%［5］。生理狀態(tài)下的這種低氧會減慢細胞周期和抑制分化，可能對神經(jīng)干細胞保持一種未分化的類似“休眠”的穩(wěn)定狀態(tài)有一定作用［6］，體外研究也證實了這一點。在缺血缺氧性腦卒中事件中，神經(jīng)干細胞所處的微環(huán)境更為特殊，其中的氧濃度較生理狀態(tài)更低，但研究顯示，在大腦中動脈閉塞引起局灶性腦缺血缺氧部位移植神經(jīng)干/祖細胞，不但神經(jīng)干細胞自身的存活能力及增殖分化能力提高，而且可以減少局部神經(jīng)元的凋亡，這個過程主要由缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor-1alpha，HIF-1α)-血 管 內(nèi) 皮 生 長 因 子 (Vascular endothelial growth factors，VEGF)信號途徑(HIF-1α-VEGF)介導［7］。因此，氧濃度是神經(jīng)干細胞生存微環(huán)境中重要的組成部分，低氧能夠增強神經(jīng)干細胞自身的增殖和成熟過程，同時神經(jīng)干細胞通過一系列的變化也影響其所處的微環(huán)境。

2 低氧影響神經(jīng)干細胞的增殖和分化

在體內(nèi)環(huán)境中，從胚胎形成到圍產(chǎn)期以及成人的神經(jīng)發(fā)育過程中，神經(jīng)干細胞所處的氧濃度是不斷變化的。如前所述，神經(jīng)干細胞在成體內(nèi)多數(shù)情況下處于一種類似“休眠”的狀態(tài)，但受到各種生理或病理性刺激時，神經(jīng)干細胞就會進入增殖及分化階段。而缺血性腦卒中是重要的刺激因素之一，Ohira等人發(fā)現(xiàn)，缺血性損傷會激活新大腦皮質(zhì)的神經(jīng)干細胞和神經(jīng)祖細胞，并促進其增殖和分化［8］。在發(fā)生缺血性腦卒中的腦組織局部會形成特殊的血管微環(huán)境，而血管周圍相對的缺血缺氧狀態(tài)是影響神經(jīng)干細胞生物學行為的主要因素。在缺血缺氧性腦卒中事件中，大腦會出現(xiàn)自身的修復，并且存在新的神經(jīng)元的發(fā)生。最新研究表明，神經(jīng)干細胞會向缺血缺氧的腦組織區(qū)域募集，趨化因子CCL2及其受體CCR2在此過程中起關鍵作用［9］。被募集到缺血缺氧的腦組織區(qū)域的神經(jīng)干細胞的存活及增殖能力都大大提高，并且通過間質(zhì)衍生因子-1和血管生成素-1與血管的重建和再生產(chǎn)生密切關聯(lián)。

在體外培養(yǎng)條件下，氧濃度對神經(jīng)干細胞增殖和分化的影響顯得更為突出。早在2000年，Studer等人就提出了氧濃度對神經(jīng)干細胞的生物學作用，他們通過對比常氧(152mmHg)和低氧(22.8±15.2mmHg)環(huán)境下鼠胚胎神經(jīng)祖細胞的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，低氧濃度促進細胞的增殖，同時減少了細胞的凋亡;另外，神經(jīng)祖細胞向神經(jīng)元的分化亦受影響，在低氧濃度下，多巴胺能神經(jīng)元比率上升到56%，而常氧濃度下其比率僅為18%［10］。而最近研究顯示，在低氧濃度下(2%O2)，胚胎干細胞在早期會出現(xiàn)一定程度的分化，且主要為神經(jīng)祖細胞的分化。這個過程主要靠成纖維細胞生長因子4(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF4)/細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinases，ERK)的自分泌和糖原合酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3，GSK-3)信號通路調(diào)節(jié)［11］。因此，氧氣在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生及形成過程中均扮演著重要的角色。Morrison等也提出在低氧濃度下(38mmHg)神經(jīng)嵴干細胞的存活率、增殖率及兒茶酚胺類神經(jīng)元的分化率均提高［12］。另有研究表明，源于孕15～16d的美國癌癥研究所小鼠(institute of cancer researcch，ICR)胚胎的神經(jīng)干細胞在15.2mmHg的氧濃度下表現(xiàn)出最強的增殖及分化能力［13］。低氧和抗氧化劑也可增加來源于腸神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)干細胞的增殖。而來源于人類胚胎干細胞的神經(jīng)干細胞，在3%氧濃度下與常氧濃度下相比其存活率亦增加，且在特定趨化因子作用下，可以向脊髓運動神經(jīng)元、多巴胺神經(jīng)元、運動神經(jīng)元前體細胞特定分化［14］。因此，在體外培養(yǎng)條件下，氧濃度會促進神經(jīng)干細胞的增殖，對其分化方向也有一定誘導作用，且主要向多巴胺能神經(jīng)元分化。在體內(nèi)及體外條件下，氧濃度對神經(jīng)干細胞的調(diào)節(jié)主要涉及以下幾個機制。

2.1 細胞因子及相關信號途徑 HIF-1是氧濃度對神經(jīng)干細胞增殖及分化調(diào)節(jié)過程中重要的細胞因子，有α和β兩個亞基。HIF-1α是調(diào)節(jié)細胞缺氧適應過程中重要的轉錄激活因子，在多數(shù)細胞和組織中，其含量很低，在胞質(zhì)內(nèi)處于失活狀態(tài);但是在缺氧條件下其含量則升高，可被激活并轉移到細胞核并與HIF-1β形成HIF-1分子，識別并結合包含有低氧反應元件的DNA序列。

在缺血性神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，HIF-1α在神經(jīng)祖細胞的存活及替代缺血壞死神經(jīng)細胞的過程中起重要作用。HIF-1α通過對細胞新陳代謝、血管再生的直接轉錄調(diào)節(jié)來完成機體對缺氧的適應［15］。在胚胎干細胞中HIF-1α主要是通過提高β-連環(huán)蛋白(β-catenin)的活性及下游效應器淋巴增強因子-1(lymphoid enhancer factor-1，LEF-1)和 T細胞因子 1(Tcellfactor4，TCF-4)的表達來調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路。這種調(diào)節(jié)在神經(jīng)干細胞中也是存在的，但是在已分化的細胞中未發(fā)現(xiàn)［16］。另有研究表明，在成年腦組織的神經(jīng)發(fā)生區(qū)域、神經(jīng)干/祖細胞、出生后的小鼠腦組織中，HIF-1α持續(xù)表達。在正常情況下的神經(jīng)干/祖細胞中，HIF-1α不會發(fā)生典型的羥基化、泛素化及退化。HIF-1α主要存在于細胞質(zhì)的膜結構中，免疫電子顯微鏡證實了含有HIF-1α的囊泡，這種結構可能防止HIF-1α的退化。而經(jīng)過HIF-1α相關基因敲除的神經(jīng)干/祖細胞對缺氧的耐受性降低，且Notch-1和β-catenin的表達水平發(fā)生顯著的變化，而這些分子與缺氧耐受存在密切關系［17］。

Wnt/β-catenin信號通路是調(diào)控細胞增殖的關鍵通路，在低氧促進神經(jīng)干細胞增殖過程中也起著重要作用。研究顯示，在利用缺氧(5%O2)環(huán)境促進海馬神經(jīng)干細胞增殖過程中，Wnt/β-catenin信號途徑起關鍵作用，β-catenin是其中主要的蛋白［18］。在體內(nèi)，Wnt/β-catenin信號通路的活性與SGZ密切相關，而該處亦是神經(jīng)干細胞發(fā)生的主要區(qū)域。HIF-1α缺失會使Wnt/β-catenin信號通路受抑制，從而使干細胞的增殖、分化及成熟受累［16］。

另外，缺氧促進神經(jīng)祖細胞的增殖和分化，此過程中促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)促進了細胞的分化，減少了細胞的凋亡。缺氧特異性的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子過度表達有利于移植神經(jīng)干細胞存活和神經(jīng)功能的改善［19］。而EPO聯(lián)合粒細胞集落刺激因子能夠促進缺血缺氧動物模型神經(jīng)功能的恢復，其機制包括增強抗細胞凋亡蛋白bcl-2的表達，增強神經(jīng)營養(yǎng)因子的合成和促進新生血管再生［20］。也有研究顯示，缺氧誘導的VEGF基因表達系統(tǒng)能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)干細胞的存活力。表達缺氧特異性VEGF的神經(jīng)干細胞應用于脊髓損傷模型中，可以提高移植細胞的存活率及促進血管再生，同時抑制不需要的細胞及血管的增生［21］。

2.2 基因水平改變 基因水平改變其實是細胞因子及相關信號通路調(diào)節(jié)過程中的一個關鍵環(huán)節(jié)，它們相互促進，不可分割。當然這個過程中也會存在一些特殊的變化。研究表明，非編碼微小 RNA(non coding RNA，ncRNA)在神經(jīng)發(fā)育、細胞存活等過程中扮演關鍵角色。在缺氧條件下，ncRNAs參與細胞增殖的調(diào)節(jié)過程，有15種微小RNA(microRNA，miR)的水平上調(diào)，11種下調(diào)，其中miR-210上調(diào)明顯。進一步研究表明 HIF-1α對miR-210有直接影響作用［22］。在基因修復方面，核酸內(nèi)切酶Neil3可以通過準確的DNA分子修復使神經(jīng)干細胞避免遭受缺血缺氧損傷，而Neil 3缺陷的神經(jīng)干細胞不能完成向神經(jīng)祖細胞的增殖和單鏈DNA氧化應激的修復［23］。另外，反轉錄酶-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)分析顯示表達細胞間黏附分子的mRNA水平亦發(fā)生改變，其中最明顯的是表達基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的mRNA。在1%氧濃度下，抑制MMP-9的活性，細胞的增殖和遷移會降低，而且，通過Wnt通路拮抗劑DKK-1(dikkopf-1)抑制HIF-1α介導的經(jīng)典Wnt信號通路時，細胞的增殖降低，MMP-9表達也減少。因此，MMP-9亦是低氧濃度促進干細胞增殖機制中的關鍵分子之一［24］。

2.3 代謝水平的變化 能量代謝中的相關分子和信號途徑影響神經(jīng)干細胞的功能，包括胰島素生長因子(insulin growth factor 1，IGF-1)-轉錄因子FoxO和IGF-1-雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號途徑、腺苷酸活化蛋白激酶、沉默信息調(diào)節(jié)因子(silentmating type information regulation 2 homolog1，SIRT1)和HIF。在低氧(3%O2)條件下，培養(yǎng)基中葡萄糖含量降低，而丙酮酸、乳酸含量升高，說明在低氧環(huán)境下，神經(jīng)祖細胞主要靠糖酵解獲取能量。而這一過程中，通過對基因分析檢測發(fā)現(xiàn)，1.24%的基因表達發(fā)生變化，其中絕大多數(shù)涉及糖酵解途徑［25］。另外，在體外缺氧誘導神經(jīng)干細胞的增殖過程中，代謝型谷氨酸受體亞型5(metabotropic glutamate receptor 5 subtype，mGluR5) 的表達有增高。在此過程中胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)和氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase，JNK)信號通路及細胞周期蛋白 D1的表達增加。這些結果還表明mGluR5參與神經(jīng)干細胞增殖，并且為中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血/缺氧損傷后的神經(jīng)功能修復提供了一個目標分子［26］。

3 缺氧預處理提高神經(jīng)干細胞對抗缺血缺氧的能力

低氧預適應是機體的一種重要的內(nèi)源性保護機制，而缺氧預處理對于神經(jīng)干細胞是否亦存在同樣的保護作用呢?如前所述，人類胚胎干細胞(human embryonic stem cells，hESCs)移植是治療缺血性卒中頗具潛力的治療方法，但是宿主的內(nèi)環(huán)境阻礙了此技術的發(fā)展。最近研究表明經(jīng)缺氧預處理的ESCs適應能力增強。將來源于hESCs的神經(jīng)球在0.1%氧濃度下培養(yǎng)12h，然后在21%氧繼續(xù)培養(yǎng)分化，免疫組織化學及電生理檢查證明預處理能增強細胞分化。且這種神經(jīng)保護作用至少持續(xù)5d，具有神經(jīng)保護作用的蛋白質(zhì)的表達也相應上調(diào)［27］。缺氧預處理增強干細胞對抗缺血缺氧能力的同時，對于移植細胞和宿主細胞的存活率都能提高。缺氧預處理的脂肪來源的間充質(zhì)干細胞與未經(jīng)缺氧預處理的相比，形態(tài)學沒有發(fā)生明顯的變化，且這種經(jīng)缺氧預處理干細胞與神經(jīng)干細胞共同移植時，能夠提高神經(jīng)干細胞的存活率，減少凋亡因子Bax的表達［28］。缺氧預處理增強神經(jīng)干細胞對抗缺血缺氧能力的機制尚不十分明確，研究表明，缺氧預處理后免疫印跡顯示HIF-1α和HIF-2α的表達增強，同時引起了一系列相互促進的反應，包括EPO、VEGF和 Bcl 2家族成員［27］。另有研究表明，在鼠神經(jīng)干細胞的缺氧預適應中涉及到Xc系統(tǒng)(胱氨酸和谷氨酸跨膜轉運的跨膜蛋白)，并證明該蛋白與缺氧預適應的神經(jīng)保護作用有關［29］。縫隙連接在缺氧預處理過程中亦發(fā)生變化，縫隙連接是宿主細胞和被移植的神經(jīng)干細胞之間重要的結構，它對細胞的功能及細胞之間的相互作用非常重要。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血缺氧性疾病中，縫隙連接會增多。此研究顯示，缺氧預處理，會使連接蛋白43(connexin 43，Cx43)的表達增高，宿主和移植物之間的信息流通提高。本研究顯示，對神經(jīng)干細胞進行3h的缺氧預處理，會使Cx43的表達提高31%［30］。

4 展望

氧濃度對神經(jīng)干細胞增殖和分化的研究使得干細胞學科更加完善和深入，并且必將推動神經(jīng)干細胞移植治療的進一步發(fā)展，尤其是在缺血缺氧性腦卒中中的應用與研究。雖然低氧條件下的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)實驗已取得一定進展，但仍存在很多的未知，這需要我們進一步的研究。

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