全反式維甲酸對阿爾茨海默病大鼠學習記憶能力及海馬Aβ蛋白沉積的影響

郭 玫， 翟蘊新， 孟令慧

全反式維甲酸對阿爾茨海默病大鼠學習記憶能力及海馬Aβ蛋白沉積的影響

郭 玫1， 翟蘊新2， 孟令慧1

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的主要臨床表現為學習記憶障礙，組織病理上可見老年斑、神經元纖維纏結(NFT)和基底前腦膽堿能神經元丟失［1］，其中老年斑的主要成分為β淀粉樣蛋白(β－amyloid protein，Aβ)。AD的病因還不是很清楚，很多學者認為Aβ的沉積是AD的始發因素，因此，針對Aβ的治療措施將成為一種很有潛力的治療方法。近年來，有研究［2］證明全反式維甲酸(all－trans retinoic acid，ATRA)具有抑制Aβ沉積的作用，本實驗通過對AD模型大鼠行為學水平的評價和海馬Aβ蛋白沉積的檢測，探討全反式維甲酸對AD模型大鼠學習記憶能力的影響及相應機制。

1 材料和方法

1.1 主要儀器設備 大鼠立體定位儀(日本東京成茂科學器械研究所);水迷宮(北京新天地公司);切片機(德國Leica);光學顯微鏡(日本Olympus);顯微圖像分析儀(日本Olympus)。

1.2 主要藥品和試劑 Aβ1－40試劑(美國Sigma公司); ATRA(美國Sigma公司);兔抗大鼠Aβ1抗(美國Sigma公司);羊抗兔IgG(武漢博士德生物工程公司);SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程公司)。

1.3 實驗動物分組 220～250g健康雄性SD大鼠(購于中國醫大動物部)，于造模前進行水迷宮訓練3d，剔除差異明顯者，隨機分為實驗組、AD模型組和對照組，每組6只。實驗組:大鼠制成AD模型3d后，按20mg/kg的劑量腹腔注射ATRA，每周3次，連續注射8w。AD模型組:大鼠制成AD模型3d后，腹腔注射等容積溶解液，每周3次，連續注射8w。對照組:大鼠大腦海馬區注射5μl生理鹽水3d后，再腹腔注射等容積溶解液，每周3次，連續注射8w。

1.4 AD動物模型的制作 首先孵育Aβ1－40，用生理鹽水溶解Aβ1－40，配成10μg/μl的溶液。37℃孵育1w，使其變為聚集狀態的 Aβ1－40。大鼠經 10%水合氯醛腹腔麻醉(300mg/kg)后，固定于立體定位儀上，常規備皮消毒，切開頭部皮膚，暴露硬腦膜。定位海馬CA1區為注射靶區(前囟后3.0mm，中線旁開2.2mm，顱骨表面下2.8mm)，微量進樣器自腦表面垂直進針，將Aβ1－401μl緩慢注入，注射速度為5μl/ h，留針10min以保證溶液充分彌散，然后緩慢撤針，縫合切口，所有操作均在無菌條件下進行。對照組注入等體積生理鹽水。術后動物單籠飼養，3d后進行水迷宮試驗，逃避潛伏期明顯延長者為造模成功。

1.5 水迷宮試驗 參照Morris［3］方法進行。大鼠在造模前訓練3d，記錄大鼠從入水到找到并爬上平臺的時間，此時間稱逃避潛伏期，每一時間段內4次潛伏期的算術平均數為這一時段的成績進行統計分析，根據第3天成績剔除差異明顯者。造模3d后進行水迷宮試驗，檢測造模是否成功。給藥8w后再次行水迷宮試驗，檢測ATRA對大鼠學習記憶能力的影響。

1.6 免疫組化法檢測Aβ蛋白 水迷宮實驗后次日即進行Aβ蛋白免疫組化染色。10%水合氯醛腹腔麻醉，經左心室灌注生理鹽水，沖凈體內血液，然后用4%多聚甲醛液灌流固定，取腦，取材范圍為前囟后2.3～3.8mm，置于4%多聚甲醛中后固定24h，常規脫水、透明、浸蠟、包埋，每隔100μm連續作6μm厚腦冠狀面石蠟切片。常規脫蠟至水，3%的去離子水孵育10min，以消除內源性過氧化物酶活性。蒸餾水沖洗，PBS浸泡3min，滴加山羊血清室溫孵育lh，傾去。滴加1∶600稀釋的兔抗大鼠Aβ蛋白一抗，4℃過夜。PBS沖洗3min×3次，滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃作用30min。PBS洗3min ×3次，滴加試劑SABC，37℃20min。PBS洗5min×4次，滴加DAB顯色劑，室溫顯色，鏡下控制反應時間。蘇木素輕度復染，脫水、透明、封片。每個標本取3張切片，顯微圖像分析系統采集圖像，細胞漿中呈棕黃色顆粒者為陽性細胞。在400倍高倍鏡下，隨機觀察海馬區不重疊的5個視野，計數陽性細胞面積百分比并分別計算其算術平均數。

2 結果

2.1 水迷宮試驗結果 造模3d后，AD模型組(25.7± 3.93s)和實驗組(27.3±3.91s)逃避潛伏期均較對照組(10.3±2.24s)明顯延長(P＜0.05);給藥8w后，AD模型組(36.6±5.27s)和實驗組(22.4±3.85s)逃避潛伏期均明顯長于對照組(8.9±1.96s)(P＜0.05)，實驗組逃避潛伏期明顯短于AD模型組(P＜0.05)。

2.2 Aβ在腦內沉積情況 對照組海馬CA1區神經元排列規則、緊密，形態完整，未見Aβ沉積，AD模型組和實驗組海馬神經元缺失，可見Aβ沉積;實驗組陽性細胞(4.54± 0.68%)顯著少于AD模型組(6.98±0.69%)(P＜0.05)。

3 討論

在阿爾茨海默病(AD)病理機制的研究中，淀粉樣蛋白級聯反應假說是廣為接受的一個學說。該假說基本觀點為Aβ的聚集和沉積及其伴隨的神經元損害是老年癡呆病理機制的中心環節。Aβ在腦組織沉積會形成老年斑，同時引起tau蛋白高度磷酸化，繼而形成神經元纖維纏結。Aβ的沉積還能引起各種免疫炎癥反應和神經毒性級聯反應，導致以海馬和大腦皮質為主的廣泛的神經元變性、死亡，出現漸進性的神經遞質主要是膽堿能和多巴胺能遞質減少，最終導致記憶和認知功能障礙，產生AD癥狀。

全反式維甲酸(ATRA)是維生素A在體內的活性代謝物，維生素A具有強大的抗氧化和抗細胞變性的作用，而氧化和細胞變性是一系列神經系統變性疾病包括AD的病理基礎。研究發現缺乏維生素A會導致大鼠大腦皮質Aβ的聚集［4］和嚙齒類動物記憶的下降［5］?？臻g學習和記憶的下降不僅見于維生素A缺乏的動物，也見于老齡嚙齒類動物［6］，給予繼甲酸(維生素A酸，retinoic acid，RA)可使癥狀得到改善。進一步的臨床研究發現AD患者腦內存在類維生素A轉運和功能的缺陷［7］，提示提高腦內類維生素A的利用可能預防或減少與Aβ相關的神經變性［7，8］。維生素A在細胞質內轉化為ATRA［9］，盡管RA具有多種立體異構體，但多以ATRA的形式存在。在試管中［2］，RAα受體信號系統可阻止細胞內外Aβ的沉積，這種作用與金屬蛋白10的表達增加有關，金屬蛋白10是一種α分泌酶，通過使淀粉前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)進入到無淀粉通路，阻止Aβ形成。ATRA還可在試管中減少新鮮的Aβ向纖維狀Aβ轉化［10］，減少Aβ沉積。連續8w給予5月齡APP/PS－1轉基因小鼠ATRA［11］，發現ATRA可通過下調p35的水平調節Aβ的軸突運輸，減少Aβ的沉積，同時ATRA可下調細胞周期依賴性蛋白激酶(Cyclin dependent kinase，CDK)的水平，而在既往的研究中［12～14］，CDK在神經元APP的磷酸化過程中起著關鍵作用。

以上的研究表明ATRA作用于Aβ沉積的多個步驟，減少Aβ的生成，抑制Aβ的聚集和沉積，但鮮少有研究證明ATRA對AD確有治療效果。本研究利用立體定位海馬內注射Aβ建立AD動物模型，通過水迷宮實驗檢測動物模型學習記憶能力的改變，免疫組化方法檢測海馬Aβ蛋白沉積，探討ATRA對AD大鼠學習記憶能力的影響及病理的改變。結果顯示ATRA組水迷宮逃避潛伏期較AD模型組明顯縮短，同時AD模型組和治療組海馬神經元缺失，周圍出現膠質細胞反應，且ATRA組海馬Aβ的沉積明顯少于AD模型大鼠，表明ATRA可以改善AD動物模型的認知功能，這種治療作用可能與海馬Aβ的沉積減少有關，這與Ding等［11］的研究結果一致。Ding發現ATRA在抑制APP/PS－1轉基因小鼠Aβ沉積的同時，還可能通過下調CDK5的水平減少tau蛋白磷酸化，同時顯著減少活化的小膠質細胞和星型膠質細胞。ATRA還能夠克服由 Aβ肽介導的膽堿乙酰轉移酶的下降［15］，使膽堿乙酰轉移酶維持在正常水平，以保證膽堿能遞質的運轉和功能。

目前AD治療研究的方向都是抑制Aβ產生、促進其降解或加強其從腦內清除。Aβ1－40肽誘導產生的抗Aβ抗體，可以使腦內Aβ沉積顯著減少，改善轉基因鼠的學習和認知功能［16］，但多中心的臨床試驗因患者出現腦膜腦炎的副反應而被中止［17］。神經生長因子對損傷神經元具有保護和修復作用，然而由于血腦屏障的緊密連接，常規給藥腦內濃度極低。尼莫地平對老年癡呆癥和腦血管痙攣有效，但肝首過效應嚴重，在腦內靶位的含量更低。ATRA作為脂溶性小分子，能夠輕易跨越細胞膜屏障，全身給藥后在腦組織高度集中［18］，且毒理學性質已確立，若能確定對AD的治療作用，是一種可行性極高的治療手段。我們應加大樣本量，繼續探索ATRA對AD動物模型的作用及機制，為AD的臨床治療提供理論依據。

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1003－2754(2012)06－0549－02

R742

2012－02－29;

2012－05－28

(1.沈陽醫學院沈洲醫院神經內科，遼寧沈陽110002;2.沈陽市第一醫院神經內科，遼寧沈陽110002)