TLR3激動劑poly(I:C)對胃癌BGC-823細胞生物學特征的影響①

屈 靜 張 建 (山東大學藥學院免疫藥理與免疫治療學研究所，濟南250012)

免疫防御是免疫系統在高等脊椎動物進化中獲得的能夠識別“自己”和“非己”、清除外源性和內源性抗原成分、保護自身內環境穩定的專門機制。其中天然免疫系統是機體抵抗外界感染和異常病理過程的第一道防線。天然免疫系統通過自身的模式識別受體(PRR)識別微生物的病原相關分子模式(PAMP)，啟動下游一系列精密而復雜的信號傳導，主要通過誘導產生干擾素、促炎因子和趨化因子，發揮直接的免疫效應或對后續的適應性免疫發揮增強和調節作用。

PRR包括 Toll樣受體(TLR)、RIG-I樣受體(RLR)和NOD樣受體(NLR)等。其中TLR3作為關鍵性的雙鏈RNA識別受體，在細胞膜和細胞內體膜上均有表達，可識別病毒來源的dsRNA及其類似物 poly(I：C)，誘導產生抗病毒反應［1］。越來越多的研究證實，PRR不僅表達在免疫細胞中，在各種實質細胞，包括腫瘤細胞中也有廣泛的表達，且表達譜各異［2］?？紤]到PRR的胞內信號傳導與其他的細胞信號傳導通路存在密切的“cross-talking”，提示在非免疫細胞中PRR活化傳遞了不同于內源性免疫激活過程的分子事件。有關研究表明，這些PRR在腫瘤發生中的作用可能是把“雙刃劍”，即在不同的腫瘤細胞和組織中，不同的PRR的激活可以產生完全不同的生物學效果。有的PRR激動劑可以促進腫瘤細胞生存，有的則明顯抑制腫瘤細胞存活［3］。因此，靶向PRR的激動劑或者拮抗劑就有可能作為潛在的腫瘤生物治療藥物來控制腫瘤進程。

poly(I：C)作為免疫治療佐劑用于腫瘤的生物治療已被廣泛證實，它可以通過激活腫瘤細胞和淋巴細胞中的TLR3或RLR，抑制腫瘤的生長，增強抗腫瘤的天然免疫應答，改善腫瘤造成的抑制性免疫環境［4］。然而，胃腺癌細胞系BGC-823細胞TLR的表達特征、poly(I：C)對BGC-823細胞生物學特征的影響以及poly(I：C)對NK細胞介導的抗胃癌天然免疫反應的直接和間接作用目前仍無報道。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 人胃腺癌細胞系BGC-823，人NK細胞系NKL，由本實驗室保存。

1.1.2試劑 poly(I：C)購于Sigma-Aldrich公司;RPMI1640培養基、F12培養基購于Gibco公司;胎牛血清購于上海復蒙基因生物科技有限公司;Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒購于碧云天生物技術研究所;EdU Apollo 567 DNA體外檢測試劑盒購于廣州銳博生物科技有限公司;流式細胞術檢測用TLR-3抗體購于Biolegend公司;總RNA提取Trizol試劑、M-MLV逆轉錄酶購于Invitrogen公司;半定量PCR試劑Easy Taq DNA聚合酶購于北京全式金生物技術有限公司;實時定量PCR試劑SYBR Green Real-time PCR Master Mix購于東洋紡生物科技有限公司;流式細胞術檢測用CFDA SE(CFSE)細胞增殖與示蹤檢測試劑盒購于碧云天生物技術研究所;Cyclin D1、7-AAD、CD107a、Perforin 和 TNF-α 抗體購于BD Pharmingen公司。

1.1.3引物設計 半定量PCR及實時定量PCR引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。引物序列如表1所示。

1.2方法

1.2.1細胞培養 BGC-823細胞用含10%胎牛血清RPMI1640培養基培養;NKL細胞用含10%胎牛血清以及100 U/ml IL-2的RPMI1640培養基培養。1.2.2總RNA的提取與RT-PCR檢測 收集2×105～5×105細胞于無 RNA酶EP管中，Trizol法提取細胞總RNA。用適量DEPC處理水溶解RNA后，檢測RNA濃度及純度。取2 μg RNA按照M-MLV反轉錄系統進行RT-PCR。半定量PCR按照下列體系配制總體積25 μl反應液：10×PCR Buffer 2.5 μl;dNTP(10 mmol/L)0.5 μl;cDNA 1 μl;Taq DNA聚合酶 0.25 μl;上下游引物(100 μmol/L)各 1 μl;H2O 18.75 μl。擴增條件：95℃ 1分鐘，1個循環;95℃ 1分鐘，54～62℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘，30個循環;72℃延伸10分鐘。實時定量PCR按照下列體系配制總體積20 μl反應液：2×SYBR Green Real-time PCR Master Mix 10 μl;上下游引物(5 μmol/L)各 2 μl;cDNA(稀釋 30 倍)6 μl。擴增條件：95℃ 1分鐘，1個循環;95℃ 15秒，60℃ 15秒，72℃45秒，50個循環;95℃ 1分鐘，1個循環;60℃ 1分鐘，1個循環;70～98.5℃ 1秒，58個循環，每一個循環結束后溫度增加0.5℃。

表1 PCR引物序列及擴增片段長度Tab．1 The primer sequences used for PCR and the length of amplified fragment

1.2.3MTT法細胞活力實驗 取對數生長期細胞，0.8×104個細胞/孔接種于96孔細胞培養板中，每組設置4個復孔，于37℃、5%CO2恒溫細胞培養箱中培養15小時。用不同濃度的poly(I：C)對細胞進行處理，總體積為200 μl，分別培養24小時和48小時。終止培養前每孔加入20 μl MTT(終濃度為1 mg/ml)，37℃孵育4小時。2 500 r/min離心20分鐘，棄上清后加入200 μl DMSO，輕輕吹打使得甲瓚沉淀充分溶解。用酶標儀檢測OD 570/630 nm處吸光度值。

1.2.4CCK-8法細胞活力實驗 細胞處理方法同上，終止培養前吸出100 μl培養上清，每孔加入10 μl CCK-8溶液，37℃孵育2小時，用酶標儀檢測OD 450/630 nm處吸光度值。

1.2.5EdU摻入法細胞增殖實驗 取對數生長期BGC-823細胞，0.8×104個細胞/孔接種于96孔細胞培養板中，于37℃、5%CO2恒溫細胞培養箱中培養15 小時。加入 50 μg/ml poly(I：C)，總體積為200 μl，培養24小時后按照產品說明書進行檢測。

1.2.6MTT法檢測NK細胞對腫瘤細胞的殺傷能力 取對數生長期細胞，將密度調至5.0×105個細胞/ml，2 ml/孔接種于6孔細胞培養板中，于37℃、5%CO2恒溫細胞培養箱中培養15小時。加入50 μg/ml poly(I：C)培養24小時后，消化細胞并計數，將密度調至1 ×105個細胞/ml，100 μl/孔接種于 96孔細胞培養板中，每組設置3個復孔。37℃、5%CO2恒溫細胞培養箱中培養12小時使其完全貼壁。取對數生長期NKL細胞，按照效靶比5∶1、2.5∶1和1.25∶1，100 μl/孔接入已鋪好靶細胞的 96 孔細胞培養板中，同時設置靶細胞對照組、效應細胞對照組和培養基對照組。共孵育10小時后，每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl(終濃度為 1 mg/ml)，37℃ 孵育 4小時。2 500 r/min離心25分鐘，棄上清。加入200 μl DMSO，輕輕吹打使得甲瓚沉淀充分溶解。用酶標儀檢測OD 570/630 nm處吸光度值。按照下列公式計算NKL細胞殺傷活性：殺傷活性(%)=1-(ODE+TODE)/ODT×100%(ODE+T：實驗孔平均 OD 值;ODE：效應細胞對照孔平均OD值;ODT：靶細胞對照孔平均OD值)。

1.2.7CFSE-7-AAD法檢測NK細胞對腫瘤細胞的殺傷能力 取對數生長期BGC-823細胞，將密度調至5.0×105個細胞/ml，2 ml/孔接種于6孔細胞培養板中，于37℃、5%CO2恒溫細胞培養箱中培養15小時。加入50 μg/ml poly(I：C)培養24小時后，按照試劑盒說明書對細胞進行CFSE標記，2.0×105個細胞/ml接種于12孔細胞培養板中，培養12小時。取對數生長期NKL細胞，按照效靶比1∶1接入已鋪好靶細胞的細胞培養板中，共孵育10小時后，收集細胞，進行7-AAD染色，流式細胞儀檢測。按照下列公式計算NKL細胞殺傷活性：殺傷活性(%)=CFSE+7-AAD+細胞比例/CFSE+細胞比例-BGC-823細胞自然凋亡率。

1.2.8流式細胞術檢測細胞分子表達 收集細胞(若對NK細胞CD107a及TNF-α進行檢測，則需要提前4小時在細胞培養基中加入終濃度6 μg/ml莫能霉素和10 μg/ml brefeldin A)后，1×PBS洗一遍，1 300 r/min離心5分鐘。棄上清，用200 μl固定液重懸細胞，4℃避光孵育30分鐘。1×PBS洗一遍，1 300 r/min離心5分鐘。棄上清，用100 μl穿膜液重懸細胞，4℃避光孵育30分鐘。按照說明書指定用量加入抗體對細胞進行染色。4℃避光孵育1小時。1×PBS洗一遍后，用200 μl 1×PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測。

1.3統計學分析 兩組數據間比較采用成對t檢驗進行統計學分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1BGC-823細胞TLR受體基礎表達水平檢測及其應答poly(I：C)后的變化 BGC-823細胞TLR受體mRNA表達水平如圖1A所示，除TLR7和TLR8外，其余8種TLR受體均有不同程度的表達，其中TLR3、TLR4 表達水平較高。50 μg/ml poly(I：C) 刺激BGC-823細胞24小時后，細胞膜上TLR3細胞陽性比例由54%升至83%，而胞內的TLR3表達水平無明顯改變(圖1B)。

2.2poly(I：C)抑制 BGC-823細胞增殖 MTT方法檢測證實，poly(I：C)作用24、48小時可顯著抑制細胞活力，且具有濃度依賴性(圖2A)。100 μg/ml poly(I：C)對細胞活力的抑制率可達40%左右。同時利用 CCK-8方法也得到了類似的結果(圖2B)。進一步利用EdU摻入實驗證實，poly(I：C)處理后的DNA合成能力明顯下降(圖2C上，放大倍數為200倍)，圖2C下為三次實驗的統計學分析結果［control組為38.18% ± 2.75%，poly(I：C)組為21.7% ±4.53%］。流式細胞術檢測50 μg/ml poly(I：C)處理24小時后Cyclin D1的表達水平由88%降至82%(圖2D上)，圖2D下為三次平行實驗統計學分析結果［control組為88.33% ±2.32%，poly(I：C)為 81.33% ± 3.05%］。

2.3poly(I：C)可改善腫瘤微環境 如圖3所示，50 μg/ml poly(I：C)處理 12 小時后，BGC-823 細胞炎癥因子 TNF-α、IL-8和免疫抑制因子 TGF-β的mRNA表達水平有顯著性降低，IL-6表達水平有所升高，圖3為三次平行實驗統計學分析結果。

2.4poly(I：C)可增強BGC-823細胞對NK細胞殺傷的敏感性 圖4A所示，MTT法實驗證實，用濃度為50 μg/ml poly(I：C)處理 BGC-823 細胞后，NKL對于poly(I：C)刺激組BGC-823細胞的殺傷功能顯著高于未處理組。NK細胞殺傷率上升幅度在5%～20%之間。利用CFSE-7-AAD染色法得到了類似的結果。如圖4B左所示，poly(I：C)處理后，被NKL細胞殺傷的BGC-823細胞(CFSE+7-AAD+)比例明顯高于未處理組。圖4B右為三次平行實驗的統計學分析結果［control組為7.71% ±1.18%，poly(I：C)組為17.34% ±1.30%］。與此同時，流式細胞術檢測NKL細胞CD107a、Perforin和 TNF-α的表達水平，如圖4C上所示，相比未處理組，NKL細胞表達CD107a以及Perforin和TNF-α的能力有所增強，圖4C下為三次平行實驗統計學分析結果。因此，poly(I：C)可以提高BGC-823細胞對NK細胞殺傷的敏感性。

圖1 BGC-823細胞TLR受體基礎表達水平檢測及其應答poly(I:C)后的變化Fig．1 Basic expression levels of TLRs on BGC-823 cells and the changes of TLR3 in response to poly(I:C)treatment

圖2 Poly(I:C)抑制BGC-823細胞增殖Fig．2 Poly(I:C)could suppress the proliferation of BGC-823 cells

圖3 poly(I:C)可改善腫瘤微環境Fig．3 poly(I:C)improved the tumor microenvironment

圖4 poly(I:C)可增強BGC-823細胞對NK細胞殺傷的敏感性Fig．4 poly(I:C)could enhance the sensitivity of BGC-823 cell to NK cell cytolysis

3 討論

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤，其死亡率在惡性腫瘤中居首位［5］。近40年來，國內外針對胃癌的基礎研究工作，包括胃癌的生物治療方案的設計和實踐探索從未間斷，并取得了很大的進展。然而，胃癌的臨床治療手段還比較有限，而生物治療策略的實現有賴于對胃癌發生發展的基本分子機制的細致了解。因此，加強胃癌病因學基礎和診治手段的研究，特別是從腫瘤免疫學的角度開展設計生物治療策略有著十分重要的意義。

poly(I：C)是雙鏈 RNA(dsRNA)的結構類似物，作為免疫佐劑其抗腫瘤作用已經得到了證實，并且在多種抗腫瘤臨床試驗中取得了一定的療效［6］。研究證實，poly(I：C)是 TLR3、RIG-I、MDA5 等多種RLR 的激動劑［7，8］，可通過活化下游信號通路進而通過cross-talking在多種癌癥中誘導細胞凋亡，同時激活天然免疫應答，進而引起全身性適應性免疫應答。目前已經在黑色素瘤、肝癌、結腸癌及白血病等癌癥中發現了poly(I：C)具有直接或間接的抗腫瘤效果［4］。因此，基于 poly(I：C)的腫瘤生物治療藥物具有廣泛的應用前景。

越來越多的研究證實，TLR3不僅廣泛表達于免疫細胞、內皮細胞以及角化細胞中，在多種腫瘤細胞中也有表達［2］。本研究在胃腺癌細胞系中檢測到TLR3 mRNA水平和蛋白水平的表達，提示在胃癌發生發展過程中TLR3也許起到了一定的作用。本研究中，外加 poly(I：C)可以觀察到胃腺癌細胞系BGC-823細胞中細胞膜TLR3表達水平的升高，因此，poly(I：C)可以至少部分通過活化BGC-823細胞的TLR3信號通路影響該細胞的生物學特征。

我們觀察到，poly(I：C)可以明顯抑制BGC-823細胞增殖，但是對細胞的凋亡沒有明顯作用(數據未顯示);同時，細胞周期蛋白Cyclin D1表達下降、DNA合成減少。說明poly(I：C)主要影響了BGC-823細胞的周期。炎癥的產生伴隨著腫瘤的發生發展［9］。本研究中觀察到 poly(I：C)處理 BGC-823細胞后，炎癥因子TNF-α和IL-8的mRNA表達水平下降，IL-6 mRNA表達水平上升;另外，poly(I：C)處理的BGC-823細胞中TGF-β mRNA表達水平下降。TGF-β是一類多重功能的免疫抑制細胞因子，研究表明該因子與多種腫瘤發生發展有關，在許多腫瘤組織中高表達，在胃癌中表達也高于正常胃黏膜組織［10］。已有實驗證實，腫瘤組織中的TGF-β可以通過抑制免疫細胞的增殖、活化、分化以及向腫瘤組織的遷移而抑制免疫應答，同時促進血管、淋巴管生成，引起腫瘤侵襲和轉移［11，12］。因此，poly(I：C)可能通過降低TGF-β的分泌，增強NK細胞殺傷功能，從而起到解除腫瘤免疫抑制的作用。

綜上所述，本研究證實，poly(I：C)不僅可以抑制BGC-823細胞增殖，而且還通過調節炎癥因子和免疫抑制因子表達，改變腫瘤微環境，增強NK細胞的殺傷功能，影響腫瘤的發展進程。本研究為poly(I：C)用于臨床治療胃癌提供新的實驗依據。

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