液質聯用技術在新生兒氨基酸篩查中的應用

陶 冶

（黑龍江省第二醫院檢測科，黑龍江 哈爾濱 150010）

1 LC/MS技術發展

1957年實現了氣相色譜與質譜的串聯應用，1977年液相色譜-質譜聯用儀正式投放市場生產。1989年J.B.Feen開發了電噴霧離子化技術（electro spray ionization，ESI）。20世紀80年代誕生的大氣壓離子化接口（Atmosphere Pressure Interface，API）技術對于生物質譜有了迅速的發展。1999年API接口的LC/MS/MSQ/TOF投放市場。近年來的質譜技術與液相色譜和毛細管電泳等高效分離技術的串聯應用，在極性強、低揮發的復雜難分離混合物方面取得了進步，大大提高了色譜-質譜聯用的分離效率，從而使得色譜-質譜聯用技術在臨床檢驗領域得以廣泛的使用。

2 質譜原理

質譜是使分子帶電，相同物質形成固定的質荷比，之后利用不同的選擇技術達到檢測目的。按選擇方式不同可以質譜分為以下類型：

四極桿質譜儀（QMS）直接對質荷比進行選擇，定量能力突出，但分辨能力不足，其他相近質荷比物質或同位素對結果產生干擾。沒有串級能力，定性能力不足。

三重四級桿（QQQ）提供了串級功能，可以在高電壓下讓樣品撞擊惰性氣體分子，從而形成固定子離子碎片，擁有選擇反應檢測掃描（SRM）、多反應檢測掃描（MRM）、單離子檢測掃描（SIM）、中性丟失（Neutral loss）等功能，可以很好的定性，也對特征基團的結構研究有很大幫助。同時它的定量能力非常強，擁有較好的定性能力，但同樣容易受到相近質荷比物質的干擾。

飛行時間質譜儀（TOFMS）利用不同質荷比在電場中飛行時間不同進行檢測，分辨能力非常好，可以排除同位素干擾，而且質荷比上限高。它也是速度最快的質譜，每秒可以進行2～100張高分辨全掃描譜圖。QTOF串聯了QMS為質量過濾器，能提供更好的定性能力。

離子阱（Ion trap）利用電場或磁場將離子捕獲在一定范圍內，逐漸增大射頻電壓，從而讓質荷比從小到大的離子逐次排出并記錄獲得質譜圖，可以很方便的進行多級質譜分析，物質結構鑒定能力強。擁有了QMS的QTrap具備了多級串聯功能，同時具備了中性丟失、MRM、SRM功能，非常適合解析未知結構樣品。串聯了TOP的離子阱－飛行時間質譜（Trap TOF）以3D離子阱作為質量選擇器，結合了離子阱的多級質譜和飛行時間質譜的高分辨能力，同時具有了串級和高分辨能力，適合定性未知未知樣品。

3 電離源離子化機制

電噴霧電離(ESI)，溶液中樣品流出毛細管噴口后，在霧化氣和強電場作用下，溶液迅速霧化并產生高電荷液滴。隨著液滴的揮發，電場增強，離子向液滴表面移動并從表面揮發，產生單電荷或多電荷離子。

大氣壓化學電離（APCI），流動相和樣品流經電離源時，通過電暈針放電，使溶劑電離，形成氣體等離子體，樣品經過等離子體時，通過質子轉移電離成離子。APCI是軟電離，產生單電荷峰，很適合測定極性弱的小分子化合物。

4 液相色譜-質譜串聯技術在臨床檢測的優勢

早期開發了很多高效液相色譜檢測方法，但是介于檢測器檢測方法的限制，不能對分離物進行很準確的定性，需要把檢測物與標準品出峰時間進行比對。對儀器的穩定性和日常維護有很高要求，而且生物樣品成分非常復雜，有時會出現保留時間相同或非常相近的不同物質，造成假陽性。對于一些物質紫外、熒光、電化學特征不明顯的物質，也沒有很好的辦法對其進行檢測。隨著液相色譜-單極質譜串聯技術的誕生，可以對物質質荷比進行檢測，較好的解決了檢測物檢測特征不明顯的問題，但是生物樣品存在分子量相同結構功能不同物質，而且在電噴霧離子化過程中會出現倍數電荷現象，對臨床檢測結果產生影響。隨著飛行時間質譜、離子阱和多級串聯質譜的誕生，很好的解決復雜生物分子定性問題。四級桿質譜有選擇能力同時具備很好的定量能力，三重四級桿質譜引入二級質譜形成串聯后擁有多種掃描方式（SRM、MRM、SIM、Neutral loss）提供更加豐富的分子信息，而且通過多反映監測模式可以快速的對目標分子進行定量。飛行時間質譜有很高的分辨率，對于同位素分析提供很大幫助。離子阱的多級質譜分析對復雜分子定性分析能力有很大提高。

5 氨基酸篩查

氨基酸在人體中有很重要的作用，與很多代謝有關，多肽和蛋白質的合成的基礎物質，區別于糖類和脂肪的物質，與生命活動有著密切的關系.其代謝過程出現紊亂會導致疾病的[1]，如尿素循環中的酶缺陷會導致尿素合成障礙，血氨升高，而過量的血氨具有神經毒性[2]。從新生兒篩查角度，時間是很重要的因素，對于大多數氨基酸代謝疾病的新生兒，最初的氨基酸篩查是正常的，但隨著飲食、蛋白質和的合成和一些其他因素導致氨基酸濃度偏離正常值[3]。有些疾病在新生兒可以臨床觀察的到，但是有些癥狀不明顯，而且篩查結果會被新生兒飲食、樣品收集時間和方法很多因素影響[4]。雖然串聯質譜是中很好的檢測方法，但也不能保證100%精確。

用質譜技術分析濾紙采集的血樣品的方法開發于1990年，最初的方法是利用單級質譜測量樣品中苯丙氨酸（Phe）含量，其導致苯丙酮尿癥的發病[5]。這種方法的建立代表質譜技術這在氨基酸檢測方面的可行性，同時濾紙采血分析也是一種別于傳統的液體分析方法。

6 樣品采集

采取新生兒血標本是篩查工作的最基本第一步，但是也是最重要的一步，對之后的篩查結果產生重要影響。采血采用國際上統一的Guthrie法。采血濾紙要求與標準濾紙一致，厚度、質地、吸水性、滲水性必須相等而且均一性很高的特制純棉濾紙。因為新生兒篩查是采用微量分析法進行的一次性檢查，要求靈敏度和精確性很高。多數實驗室采用國際認可的Schleicher & Schuell 903特種濾紙，可以很好的保證篩查質量。采血時間要在新生兒出生72h，而且吃足6次奶后進行，否則有可能在無蛋白負荷的情況下出現PKU篩查陰性。采血部位為嬰兒足跟內側或外側，為了使血流充分，可按摩和熱毛巾熱敷嬰兒足，在酒精消毒后用采血針刺穿，棄掉第一滴血后收集之后的血，并且使血充分滲透到濾紙背面，過程中應避免擠壓采血而引起溶血，不要直接接觸造成人工污染，。同時要求每個嬰兒采3個血斑，每個血斑直徑不小于10mm。采血完成后將濾紙平放在清潔處自然晾干，然后裝入塑料袋，并在4℃冰箱保存，定期統一送到實驗室進行檢測。

7 樣品處理與測試

用打孔器在濾紙血斑打直徑為5.5mm圓片，放入PV管中，加入200μL甲醇萃取，振蕩15min，離心后取100μL上清液加入另一個PV管，氮氣吹干.加入100μL HCL-正丁醇，在超聲恒溫水浴65℃酯化30min，氮氣吹干，向PV管中加入100μL甲醇上機測試[6]。

所有的α-氨基酸都產生甲酸這個中性分子，用質譜MS/MS分析需要對氨基酸進行衍生化以增加電離，通常做法是加入正丁醇超聲恒溫水浴。經過丁酯化的α-氨基酸在碰撞誘導電離（CID）后產生一個102Da的中性分子丁酰甲酸（HCOOC4H8），使用中性丟失掃描可以很準確的對其定量。而精氨酸需要進行NL 161Da掃描；瓜氨酸和鳥氨酸需要進行NL 119Da掃描；甘氨酸產生56Da碎片[7]。

8 苯丙酮尿癥篩查

在新生兒篩查中開展最為廣泛的是苯丙酮尿癥篩查，病因是由于肝臟中苯丙氨酸羥化酶缺乏或者活性減低從而導致苯丙氨酸代謝障礙的一種遺傳疾病。苯丙酮尿癥又分為經典型苯丙酮尿癥，由于苯丙氨酸羥化酶缺乏導致的；另外一種是四氫生物蝶呤（BH4）缺乏癥，由于苯丙氨酸羥化酶的輔助酶BH4缺失造成。

早期利用Phe作為PKU的唯一指標，從而容易導致結果的假陽性[8]，為了減少這種現象，現在使用Phe與Tyr的摩爾比值作為檢測指標。從轉化過程來看，苯丙氨酸脫氫酶的缺失會阻礙Phe轉化為Tyr，因此Tyr主要是通過飲食攝入，但這并不能保證體內Tyr的濃度，會導致隨著時間的增長Tyr的濃度反而降低，Phe的濃度升高，因而Phe與Tyr的摩爾比值要比單一的Phe濃度更具有臨床意義。

但采取Phe與Tyr的摩爾比值并不能完全消除假陽性，由于Tyr的溶解度不好，通過靜脈注射給新生兒的氨基酸中Tyr的含量很少，這導致了檢測中Tyr沒有伴隨著Phe升高而升高導致結果異常[9]。這種假陽性可以通過采集時間的改變而消除。

另外一種情況是新生兒的酶活性不高，影響肝功能，或者是采血濾紙過飽和影響到結果。這時可以檢測血中全氨基酸，因為采血引起的結果異常導致全部氨基酸量的改變，從而使Phe與Tyr的摩爾比值合理。

當然，如果利用體外補充氨基酸的方法，會導致血中氨基酸一定程度的升高[10]，例如Leu、Ala等，有可能導致Phe的升高，但由于Tyr溶解度的問題使其濃度提高不明顯，這引起了Phe與Tyr的摩爾比值的升高，從而引起假陽性。這時通過測量Phe與Leu的摩爾比值，就可以消除PKU的可能性。

9 質譜篩查面臨的挑戰

9.1 費用問題，液相色譜質譜聯用儀費用很高，人員培訓和日常消耗也很大，需要精心維護。

9.2 新生兒篩查的主要挑戰是建立能夠避免假陽性和最小化假陽性的分析臨界值，通常假陽性占到異常結果的90%，對新生兒家庭造成心理壓力和費用壓力。這需要平衡好假陽性的接受程度和診斷疾病的需要，還要對可能產生假陽性的因素如：出生體重低、早產、營養修飾等。

[1]Shintaro I,Stephen VD,Kazutaka S,et al.Determination of metabolic flux changes during fed-batch cultivation from measurements of intracellular amino acids by LC-MS/MS[J].J Biotechnology,2007,128(1):93-111.

[2]楊艷玲,孫芳,錢寧,等.尿素循環障礙的臨床和實驗室篩查研究[J].中華兒科雜志,2005,43(5):331-334.

[3]Uttam G,Majed D.Expanded newborn screening of inherited metabolic disorders by tandem mass spectrometry: Clinical and laboratory aspects[J].Clinical Biochemistry,2006,39(4):315-332.

[4]Donald HC,Theodore AK.A biochemical perspective on the use of tandem mass spectrometry for newborn screening and clinical testing[J].Clinical Biochemistry,2005,38(4):296-309.

[5]Lehotay DC,Hall P,Lepage J,et al.LC–MS/MS progress in newborn screening[J].Clinical Biochemistry,2011,44(1):21-31.

[6]Mariella Z,Lorena G,Franco Z,et al.Methodfor the quantif i cation of underivatized amino acids on dry blood spots from newborn screening by HPLC–ESI–MS/MS[J].J Chromatography B,2006,831(1-2):267-273.

[7]W.A. Huub Waterval,Jean L.J.M.Scheijen,Marjon M.J.C.Ortmans-Plotman,et al.Quantitative UPLC-MS/MS analysis of underivatised amino acids in body fl uids is a reliable tool for the diagnosis and follow-up of patients with inborn errors of metabolism[J].Clinica Chimica Acta,2009,407(1-2):36-42.

[8]Ji-Seon J,Hee-Jung S,Yong-Moon L,et al.Determination of phenylalanine in blood by high-performance anion-exchange chromatographypulsed amperometric detection to diagnose phenylketonuria[J].J Chromatography A,2009,1216(30):5709-5714.

[9]A. MacDonald,J.C. Rocha,M. van Rijn,et al.Nutrition in phenylketonuria[J].Molecular Genetics and Metabolism,2011,104(Suppl):S10-S18.

[10]Margreet van Rijn,Marieke Hoeksma,Pieter J.J. Sauer,et al.Diurnal variations in blood phenylalanine of PKU infants under different feeding regimes[J].Molecular Genetics and Metabolism,2011,104(Suppl):S68-S72.