動物基因定位的發展及其分子遺傳標記

張建軍 薛科邦 茍想珍 疇 鑫 謝文章

（1.甘肅省畜牧獸醫研究所，甘肅，平涼 744000；2.甘肅省華池縣畜牧獸醫站，甘肅，華池 745600；3.甘肅省環縣畜禽改良站，甘肅，環縣 745700）

近些年來，世界上的一些發達國家對動物基因定位的研究給予極大的重視，撥出較多的資金，開展了一系列較系統的研究，自中、美、日、德、法、英國科學家聯合宣布，他們繪制出了準確、清晰、完整的人類基因組圖譜，標志著生命科學又向縱深邁進了一步。同時，隨著分子遺傳標記技術的更加成熟，這一重大成果也使動物的基因定位研究進入了一個嶄新發展的時期。

1 動物基因定位研究動態

動物基因定位研究被認為是未來動物分子育種的基石。由此，建立起來的DNA標記技術是未來動物育種的主要工具。動物基因定位的目標就是要在DNA水平上，確定控制經濟重要性狀座位。基因定位研究結果具有巨大的應用價值，國際著名數量遺傳學家Soller估計基因定位技術可使奶牛年產奶量在短時間內增加3 000 kg；而英國著名遺傳育種學家haley認為基因定位技術可在本世紀末使豬產仔數增加1頭，其純利對英國養豬業而言是7億英鎊。動物基因定位是未來動物品種改良的主要手段，特別是要在未來持續增加產量和改進質量以及迅速響應市場方面，只有分子育種才能快速做到，因此各個國家都將動物基因定位研究納入國家重大優先研究項目。

歐洲豬基因定位計劃（pig genome，project，pigmap）制定于1989年，并在1990年正式啟動，有歐共體10個國家的16個實驗室參加1993年，為了加強與美國和日本的競爭能力，歐洲Pigmap計劃向其他非歐共體國家開放，參加的國家數增至14個，實驗室數增至22個。Pigmap實施至今，發表了近500篇高水平論文，獲得了28項專，帶動了世界動物基因定位研究的發展。

美國是世界上開展動物基因定位研究最早的國家，但在1991年前都是些零散的研究活動。1991年美國農業部（USDA）同時資助啟動了美國的豬、牛和雞基因定位計劃，即著名的“國家動物基因組研究計劃”，由農業部直接領導，各個物種都成立了相應的協作委員會，各委員會又設1～2個著名科學家作為負責人。

我國動物生物技術研究與開發起步較晚，但在近年來卻取得了很大的成績，特別是在我國863計劃的支持下，已逐步由單純的模仿開始了自主創新，一批以動物生物技術為核心技術的企業也正在發展壯大。1999年我國有一定動物生物技術研究與開發規模的公司是21家，總產值不超過 8 500萬人民幣，然而政府與企業累計共同投入的研究與開發經費卻達到1.6 億人民幣。主要資助和正在開展的研究有鹿、牛、黃鱔性別基因定位，家豬毛色基因定位，雞性連鎖矮小基因的定位，太湖豬高繁殖力基因的定位，豬、雞數量性狀的基因定位等。

2 DNA分子遺傳標記

DNA 分子標記主要是指 DNA 水平上的變異。隨著分子生物學的迅速發展，DNA 分子標記開始得到應用，通過測定遺傳物質DNA 本身的變異，為遺傳多樣性檢測提供一系列更加直接有效的途徑，為基因的定位和改良提供了技術保障。基因定位技術主要是找到影響數量性狀位點 （quantitative trait loci，QTL）中的主效基因，或與有連鎖關系的DNA標記，通過標記輔助選擇進行定向育種；基因改良是通轉基因技術將產生特定性狀的外源性基因導入到動物基因組上，從而達到改良重要生產性狀或非常規性育種性狀的目標。目前，在動物基因定位和改良上應用較廣泛的分子遺傳標記有限制性片段長度多態分析技術、隨機引物擴增多態性DNA技術、擴增片段長度多態性分析技術和單核苷酸多態性標記等。

2.1 限制性片段長度多態標記（RFLP）

RFLP標記是指用限制性內切酶切割不同個體基因組DNA后，含同源序列的酶切片段在長度上的差異。其多態性產生的原因是DNA 某區域發生缺失、插入、突變引起酶切位點的消失、出現、位移或染色體重排引起電泳帶改變。RFLP 的探針有 cDNA 探針和基因組 DNA 探針，前者有較強的保守性，可用于基因組比較和種群起源演化；后者檢測的多態頻率較高，但種屬特異性強。RFLP標記的是單拷貝編碼序列，大多數屬單位點上的雙位點基因，具有共顯性特點，因此主要用于遺傳連鎖圖的繪制和目的基因的標記。

2.2 隨機擴增多態性標記（RAPD）

RAPD以基因組 DNA 為模板，利用非特異性寡核甘酸為引物（5～10 bp），通過DNA聚合酶鏈式反應擴增基因組。該類標記能檢測到多個基因座位，多態信息含量變化范圍大（0.2～0.9），可在對物種沒有任何分子生物學研究的情況下進行多態性分析。所用引物可人工合成，適用于生物界的不同物種。RAPD技術是在1990年由William和Welsh等人利用PCR技術發展的檢測DNA多態性的方法。RAPD標記比RFLP具有簡便、快捷和多態性檢出率高等特點，其主要應用于目標基因標記、遺傳資源鑒定及分類。

2.3 擴增片段長度多態性（AFLP）

AFLP 的檢測原理是使用雙鏈人工接頭與基因組DNA 酶切片段相連接作為擴增的模板，對酶切片段進行選擇性擴增。由于不同來源的 DNA 酶切片段存在差異，導致產生的產物呈多態性。AFLP 實際是 RFLP 與PCR 相結合的一種技術，具多態性強，一般可檢測 40～150 個擴增產物，非常適合繪制品種的指紋圖譜及分類研究；穩定性好，重復性強以及樣品適應性廣等特點。

2.4 單核苷酸多態性（SNPS）

SNPS是1996 年美國麻省理工學院的人類基因組研究中心的 E.S. Lander 提出的一類遺傳標記系統。是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列的多態性，包括堿基的轉換、插入及缺失等形式，目前，SNP標記主要用于基因作圖、人類疾病相關基因及藥物設計研究等方面。隨著分子標記技術與各種生物技術的結合，在對家畜重要經濟性狀遺傳機理的分析、目的基因的篩選和定位，選擇效率的提高、種質資源的保護研究和有效利用中，SNPs 標記技術將發揮巨大的作用。

2.5 單鏈構象多態性（SSCP）

SSCP其原理是單鏈 DNA 片段呈復雜的空間折疊構象，這種立體結構主要是由其內部堿基配對等分子內相互作用力來維持的，相同長度的單鏈 DNA 當有一個堿基或者多個堿基發生改變時，就會影響其空間構象，使構象發生改變，在中性聚丙烯酰胺凝膠中其遷移率不一樣，將不同遷移率的個體測序，可以非常準確地將構象上有差異的分子分別開來。單鏈構象多態性最初是1984 年由 Noumi 等對正常和突變的大腸桿菌 F1-ATPase 基因進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析時發現的一種探測基因點突變的方法。1989 年，Orita將探針雜交和放射自顯影技術應用到 SSCP 中。同年 Orita 等將 PCR 同 SSCP 相結合，使檢測的靈敏度大大提高，并省去酶切等步驟，從而避免了先前采用基因組 DNA 特異性不強的缺陷。

3 展望

DNA分子標記的產生并應用于動物育種實踐開創了動物基因定位和改良的新領域，大多數科學家和企業家都相信，動物基因定位研究將在21世紀形成低投入、高產出的巨大產業，是動物育種中最充滿活力和前景最為燦爛的高新技術。在實際應用中將各種分子遺傳標記相互結合，相互補充，可以從各個角度更深入全面地了解動物的本質，通過研究動物的遺傳結構和控制機制，更好地揭示遺傳結構和功能的內在聯系，使動物定向培育的前景更加光明。

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