瘤胃真菌體外培養條件對其產酶活性的影響

青島農業大學動物科技學院 周光明 王利華

瘤胃真菌在粗飼料消化中起著非常重要的作用，但由于瘤胃真菌屬于嚴格厭養菌，在工業生產中的應用受到一定的限制。因此，營造適合瘤胃真菌生長的環境，提高瘤胃真菌生長速度和產酶效率，將會對瘤胃真菌在秸稈處理、新型飼料及新酶源的開發等領域的廣泛作用起到一定的推動作用。

1 環境因素

1.1 溫度對瘤胃真菌的影響 微生物的生長和酶的合成均是在酶的催化下進行的，溫度是保證酶活性第一要素，因此發酵過程中必須保證適宜的溫度。Lowe等（1987）研究表明，厭氧真菌在36～41℃內均能較好生長，其最適溫度為39℃，在此溫度下產酶活力最高，生長速度最快，培養溫度過高或過低酶活都會大幅度降低。

1.2 pH對瘤胃真菌的影響 在瘤胃中，pH通常保持在5.8～6.8，厭氧真菌在這一范圍內能較好生長。 Barichievin和 Calza（1990）研究表明，培養基的pH對厭氧真菌有一定的影響，pH為6.0時酶活力最高。王照華（2004）研究發現，瘤胃真菌最適pH為6.5～7.0。

2 營養因素

2.1 碳源的影響 碳源作為瘤胃真菌的能量來源，對瘤胃真菌的生長和生產的影響尤為重要。朱崇淼等（2004）在研究瘤胃真菌A4菌發酵參數時發現，在分別以稻草秸、玉米秸、花生蔓、濾紙作為碳源時，A4菌均可產生具較高活力的木聚糖酶，其酶活分別為 14.3l、11.39、6.99 U/mL和 13.37 U/mL， 比活力分別為 26.96、15.95、22.29 U/mg 和25.12 U/mg；研究還發現，以稻草秸和濾紙為碳源時，二者培養液中羧甲基纖維素酶活力無顯著差異（P>0.05），且均顯著高于玉米秸組和花生秸組（P<0.05）。厲學武（2011）在以玉米秸、花生蔓、地瓜蔓及麩皮作為不同的發酵底物，篩選木聚糖酶和羧甲基纖維素酶體外培養的最優發酵條件時發現，以玉米秸稈為碳源時木聚糖酶活為最高，與其他三種碳源之間差異顯著（P<0.05）；以地瓜蔓為碳源時，羧甲基纖維素酶活最高，與花生蔓之間差異顯著（P<0.05）；以地瓜蔓為碳源時，木聚糖酶比活力和羧甲基纖維素酶比活力均為最高，與其他三種底物之間差異性極顯著（P<0.01）。以上試驗中，瘤胃真菌酶活差異較大，其原因可能是不同碳源誘導產生的差異。

2.2 硫源的影響 在瘤胃真菌合成含硫氨基酸的過程中為機體提供了硫源，但是瘤胃真菌利用不同的硫源的難易程度不同，而且含硫氨基酸在微生物合成的酶中又有重要的作用，所以硫源對瘤胃真菌的生長和酶活會產生重要的影響作用。鄭拉弟 （2009）研究硫酸鈉和硫化鈉的不同水平（0.18%、0.25%、0.30%）對瘤胃真菌數量和瘤胃羧甲基纖維素酶活力的影響，結果表明，硫酸鈉和硫化鈉均能促進瘤胃真菌的生長；日糧干物質中硫含量為0.25%時，瘤胃真菌的平均數量顯著增加；此外，研究還發現，硫酸鈉和硫化鈉均能顯著提高瘤胃羧甲基纖維素酶活力，但是總的看來，硫酸鈉的效果要優于硫化鈉。

2.3 氮源的影響 氮源在氨基酸或者蛋白質的合成過程中起著重要的作用，因而也會影響瘤胃真菌的生長和其產酶的活性。

Dijkerman等 （1996） 報道， 厭氧真菌Piromyces E2菌在以胺鹽為氮源時生長最好，以谷氨酸為氮源時也可生長，但以其他氨基酸、清蛋白、尿素、硝酸鹽為氮源時，該菌的生長受到抑制。王海榮（2006）研究發現，不同氮源日糧對瘤胃真菌濃度和數量影響顯著（P<0.05）；其中棉籽粕組顯著高于魚粉+麩皮組和豆粕組（P<0.05）；且瘤胃液相木聚糖酶活受氮源影響顯著（P<0.05），其中魚粉組極顯著高于棉籽粕組和豆粕組 （P<0.01），棉籽粕組又顯著高于豆粕組（P<0.05）。除較常規的飼料原料外，還有學者對酵母膏等不常用于飼料配合的原料做了相關研究。朱崇淼等（2004）研究表明，酵母膏濃度為 0、0.25、0.50 g/L的3個處理組所產生的木聚糖酶活及比活力均顯著低于1.0 g/L組 （P<0.05）；酵母膏濃度為0、0.25 g/L組的羧甲基纖維素酶活及比活力均顯著低于0.50 g/L和1.0 g/L組（P<0.05）。由此可見，較高濃度的酵母膏可促進木聚糖酶和羧甲基纖維素酶的產生。于紅霞和王利華（2009）研究酵母膏的不同添加量（0%、5%、15%）對瘤胃真菌體外培養的影響，結果表明，酵母膏添加量對纖維素酶活影響顯著（P<0.05），且纖維素酶活在24、48 h時最高；隨酵母膏添加量增大，培養底物的粗蛋白質和真蛋白含量也明顯增大，表明酵母膏對瘤胃真菌的生長有促進作用。

2.4 飼料中精料與粗料的影響 飼料的精粗比也會對瘤胃真菌的生長產生一定的影響，原因可能是由于精粗比會影響到瘤胃內的pH，從而影響瘤胃真菌的存活。也有可能是由于精料過多會加快瘤胃細菌的增殖，使得瘤胃細菌在瘤胃內占據了優勢，從而影響了瘤胃真菌的生長；而過少時，瘤胃真菌又得不到充足的營養，生長也會受到限制。 孫云章等（2006）研究不同精粗比（0∶10、3∶7、5∶5、7∶3、10∶0）對瘤胃真菌和發酵特性的影響，結果表明，與0 h相比，發酵24 h時精粗比3∶7和5:5兩組的瘤胃真菌數量均有較大幅度的增加，其中精粗比為3∶7時增加的幅度最大，為0 h的10倍，精粗比7∶3組和全粗料組的真菌數量明顯減少，全精料組甚至檢測不到真菌；發酵48 h時，全粗料組羧甲基纖維素酶活顯著高于其他4組（P<0.05），且其他 4 組之間差異不顯著（P>0.05）；木聚糖酶酶活則隨底物精料比例的上升而顯著下降（P<0.05）。由此可見，全粗料組的羧甲基纖維素酶和木聚糖酶酶活最高，說明纖維含量豐富的底物可誘導共培養系統中纖維降解酶的產生，但是有少量的精料則更有利于瘤胃真菌的增殖，所以要根據具體需要選擇底物的精粗比，這樣才可以得到更多的產品。

2.5 無細胞瘤胃液的影響 無細胞瘤胃液對瘤胃真菌產酶促進作用的機理尚不明確，原因可能是，瘤胃真菌在生長產酶過程中除了需要能量和蛋白質，還需要一定的無機鹽甚至一些生長因子，而無細胞瘤胃液恰恰滿足了瘤胃真菌這兩大需求。朱崇淼等（2004）在產酶培養基中分別添加不同濃度（0、50、100、170 mL/L）的無細胞瘤胃液，進行發酵試驗，結果表明，3個較低濃度組酶活及比活力均低于高濃度組，且3個較低濃度組之間無顯著差異（P>0.05），說明培養基中無細胞瘤胃液必須處于較高濃度才能促進A4菌羧甲基纖維素酶的產生；此外，研究還發現無細胞瘤胃液濃度的高低對木聚糖酶活及比活力的影響均不顯著（P>0.05），表明無細胞瘤胃液的濃度對木聚糖酶影響不大或無影響。

3 其他因素

3.1 飼料加工方式的影響 不同的飼料加工方式可能會改變飼料中纖維素和木質素的結合狀態或者可為瘤胃真菌或其產生的酶提供更多的附著位點，而且有些加工方式還會改變精粗料之間的混合程度，從而影響瘤胃真菌的生長速度和其產生的酶的活性。Cann等（1993）研究發現，飼料經過氨化處理后有增加瘤胃厭氧真菌的趨勢。Martin 等（1993）和 Williams等（1989）研究發現，瘤胃中纖維物質主要由與固體結合的瘤胃真菌釋放的酶所消化。據此，陳小連（2007）測定了發酵底物上的纖維分解酶酶活，結果顯示，飼料經過化學處理可以特異地提高纖維分解酶酶活，NaOH處理顯著提高羧甲基纖維素酶和微晶纖維素酶酶活，而NH4HCO3處理對上述兩種酶酶活影響不顯著；與未處理組相比，NaOH和NH4HCO3這兩種處理方法都能顯著提高木聚糖酶活，并且木聚糖酶酶活隨著培養時間延長有逐漸升高的趨勢，且NaOH處理組效果更好。

化學處理會改變飼料的內部結構，改善飼料品質，從而更易于被瘤胃真菌利用。但有研究發現，僅僅簡單的混合也會改善瘤胃真菌的營養條件。李德允（2006）分別對肥育期荷斯坦奶牛采用兩種給料方式：全混日糧（TMR）和精粗料分離飼喂，結果發現，在第6小時和第9小時，TMR試驗組的真菌數量顯著高于精粗分離組（P<0.05）。

3.2 非離子型表面活性劑的影響 非離子型表面活性劑對瘤胃真菌的影響作用，可能是由于其能降低真菌表面的表面張力，促進相關酶或者有害物質的排除或者營養物質的吸收，從而加快瘤胃真菌的代謝速度引起的。Lee等（2003、1998）研究發現，添加0.05%的吐溫80，能顯著提高單中心真菌和多中心真菌的生長速度 （P<0.05）；然而，當添加量為0.10%時，單中心真菌的生長受到抑制，但多中心真菌的生長速度依然顯著提高（P<0.05）。這說明低劑量的吐溫80對瘤胃真菌有營養改善或促進代謝的作用，而高劑量的吐溫80對瘤胃真菌的這種作用過強，甚至改變了單中心真菌的細胞內環境，從而表現出了一定的毒害作用；而多中心的真菌對這種作用有一定的耐受性，所以低濃度和高濃度的吐溫80對其均表現出促進生長的作用。

4 小結

瘤胃真菌的體外發酵過程不僅受飼料加工方式、非離子型表面活性劑等因素影響，而且還受環境、營養等因素的影響，此外，目前還存在很多亟待解決的問題，如瘤胃真菌發酵產酶所需時間較長，發酵要求苛刻，發酵條件之間的組合優化等工作仍有待完善。

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