大環內酯類抗生素有關物質檢測方法研究進展

鄧晶晶，唐克慧

(1.成都醫學院藥學院實驗教學中心，四川 成都 610083;2.中國醫藥集團四川抗菌素工業研究所，四川 成都 610051)

有關物質多指藥物中的有機雜質，也包括殘留溶劑和手性化合物中無特殊毒性的對映體。其主要來源于藥物的制備和貯存過程，如合成過程中的副反應產物，原料中的雜質，純化和精制操作中帶入的雜質，以及因成品貯存條件因素引入的雜質等。藥物中含有雜質會降低其療效和影響其穩定性，甚至對人體健康有害或產生其他副作用。因此，對有關物質進行檢測，控制藥物純度，以控制藥物質量至關重要。綜合大環內酯類抗生素有關物質檢查的相關報道，主要是根據吸附或分配性質等的差異采用色譜法對雜質進行測定，如薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、高效液相－質譜聯用技術(LC－MS)及氣相色譜法(GC)等，也有的采用毛細管電泳法(CE)。其中氣相色譜法主要用于殘留有機溶劑的檢測，在此重點闡述TLC法、HPLC法、LC－MS法及CE法等在該類抗生素有關物質檢測中的應用，并對其發展前景進行了展望。

1 薄層色譜法

TLC法是一種檢測有關物質的經典方法，具有快速、簡便、操作簡單等特點，尤其適用于檢測無紫外吸收的物質。目前，各國藥典在采用TLC檢測該類抗生素中某一藥物的有關物質時，均采用了系列對照溶液進行梯度點樣的方法來“半定量”地評估雜質量，并對雜質數目、最大雜質量和總雜質量均有詳盡的評判要求。在用TLC檢測有關物質時，若分離效果達不到要求，則影響測定的準確性，故應有系統適用性試驗檢測系統的有效性。余立等[1]在用TLC檢測阿奇霉素及其有關物質時，考慮到紅霉素既是阿奇霉素的合成前體，又是其主要降解產物，且易于得到，而斑點又和阿奇霉素相鄰，因此選擇紅霉素作為該色譜系統的適用性試驗指標物質，并規定阿奇霉素與紅霉素主斑點要完全分離，以保證色譜系統的有效性。唐克慧等[2]在用TLC檢測克拉霉素注射液中的有關物質時，對克拉霉素注射液采用乙酸乙酯作為萃取溶劑分多次萃取的方法進行前處理，并通過試驗證明了該萃取方法的可行性，同時建立的萃取－薄層色譜法較成功地解決了輔料嚴重干擾克拉霉素注射液中的有關物質檢測這一難題。

2 高效液相色譜法

HPLC法具有分離效率高、選擇性好、分析速度快、操作自動化和應用范圍廣的特點，目前是各類藥物有關物質檢測的主要方法，如雜質對照品法(適用于已知雜質)、主成分自身稀釋對照法(適用于一般雜質檢查，雜質成分少且尚不能取得其對照品，簡稱“自身對照法”，分為加校正因子計算和不加校正因子)、歸一化法(現已不多用)，第一法為外標法、定量檢測，后兩法均為限量檢測[3]。在對大環內酯類抗生素和利福霉素類抗生素的有關物質檢測中，HPLC應用非常廣泛。在已見報道的方法中，檢測器的選擇又以紫外檢測器為主，如李戰[4]、林玲等[5]、戴玉榮等[6]、楊亞莉等[7]、魏王君等[8]分別采用該方法對大環內酯類抗生素的代表藥物進行了有關物質的檢測。而根據大環內酯類抗生素的結構特點，所選擇的紫外檢測器的波長基本都處于低波長位置，但在此位置檢測易產生干擾。因此，除紫外檢測器外，電化學檢測器在該類抗生素的相關物質檢測中也有應用。電化學檢測器是根據電化學原理和物質的電化學性質進行檢測，在液相色譜中，可以檢出所有電活性物質。欒杰等[9]和李海英等[10]均采用電化學檢測器的高效液相色譜法進行阿奇霉素的有關物質檢測，定量檢出了阿奇霉素中紅霉素過氧化物、阿奇霉素脫氧化物、阿奇霉素雜質A和N脫甲基阿奇霉素等有關物質。經試驗發現，該法較之該類藥物國內通用的微生物檢定法有很大的優越性，具有靈敏度高、線性范圍寬、精密度好、專屬性強、易于準確定量等優點，大大提高了檢測效率和檢測速度。

3 高效液相－質譜聯用技術

LC－MS聯用技術將高分離性能的LC技術與能夠獲取豐富化學結構信息的MS技術相結合，可直接對微量未知化合物進行結構鑒定。與以紫外檢測器為檢測手段的HPLC法相比，MS檢測技術提供了更快速、有效的未知雜質鑒定，省去了分離與純化過程，有效節約了時間。Govaerts等[11]采用LC－MSn對琥乙紅霉素中的4種未知雜質進行了鑒定。Debremaeker等[12]利用液相色譜－離子阱質譜聯用技術成功分離和鑒定出阿奇霉素樣品中6個未知的相關物質。因此，充分利用LC－MS技術獲得的信息可迅速實現藥物有關物質的分離及結構鑒定。

Kumar等[13]在進行紅霉素樣品的檢測鑒定過程中，首先利用MS/MS和MSn技術建立了相關物質譜庫，之后再運用液質聯用方法將紅霉素樣品中的相關物質與之前的相關物質譜庫中的結果進行對比，從而鑒定出紅霉素中的8個未知相關物質。Deubel等[14]將電噴霧離子化多級質譜分析方法用于紅霉素A(EA)及其相關物質的測定，利用多反應監測技術(MRM)成功檢測了紅霉素A及其相關物質，并通過較先進的離子阱系統軟件推測得出預期效果之外的2個新的相關物質的結構。結果顯示，該方法的準確度、精密度、靈敏度均超過要求，且線性關系良好。Leonard等[15]在檢測克拉霉素及其有關物質時采用LC－MSn技術，通過試驗對克拉霉素中的1個未知雜質進行了結構確證，并分離檢測出另外2個未知雜質。Pendela等[16]在檢測螺旋霉素的有關物質時采用了液質聯用方法，其液質條件中利用大氣壓化學離子化源(ACPI)作為接口技術，該技術是一種非常耐用的離子化技術，通常不需特殊優化，容易使用。在該試驗條件下，通過對螺旋霉素及其有關物質的碎片離子的分析，共發現17個有關物質，其中3個為歐洲藥典中已經報道的特定雜質。

4 毛細管電泳技術

CE也稱高效毛細管電泳(HPCE)，是近年發展起來的一種儀器分析方法，可廣泛應用于分離、分析有機與無機陰、陽離子，手性分子、中性分子及大分子，以及單細胞。CE是在毛細管分離通道中，在電場作用下，帶電質點(離子或膠粒)在電解質溶液中，向電荷相反的電極遷移。在遷移過程中，因帶電質點的電荷數量、電荷符號與質點大小的差別，造成遷移速率的不同而達到分離。

在大環內酯類抗生素的有關物質檢測中用到了2種毛細管電泳的分離分析技術，分別為毛細管區帶電泳(CZE)和毛細管膠束電動色譜(MECC)。前者是通過在充滿電解質溶液的開口毛細管中，荷質比不同的組分在電場作用下，電泳淌度不同而被分離的，荷質比大的離子電泳淌度大，先到達檢測窗口;反之，則后到達。該方法常作為反相高效液相色譜的補充。Lalloo等[17]通過試驗考察，確定了檢測紅霉素中有關物質的毛細管區帶電泳工作條件為150 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.5)－35%乙醇，分離電壓30 kV，檢測波長200 nm。試驗結果顯示，該方法可準確用于紅霉素和其相關物質(如紅霉素C等)的分離和定量分析。而MECC則具有電泳和色譜的兩重分離性能。該分析方法是在緩沖液中加入表面活性劑，當表面活性劑的濃度超過臨界濃度(CMC)時，則聚結而形成膠束，從而在含有膠束的背景電解質中進行毛細管電泳。在MECC系統中，實際存在著類似于色譜的兩相:一相是流動的水相;另一相是起到固定作用的膠束相。樣品在這兩相之間分配，并由于其在膠束中不同的保留能力而產生差速遷移。Tobback[18]等用膠束電動毛細管色譜法測定了大環內酯類抗生素中泰樂菌素及其相關物質。測定條件為，以80 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH=7.5)－20 mmol/L膽酸鈉－7 mmol/L溴化十六烷基三甲銨為背景電解質，運行電壓18 kV，檢測波長205 nm，在該測定條件下泰樂菌素和其相關物質在15 min內能夠得到有效分離。

5 結語

綜上所述，目前對大環內酯類抗生素有關物質的檢測主要還是采用色譜分析方法，而HPLC法又因分離效能高、應用范圍廣，成為主要檢測手段，但HPLC法及液質聯用技術并不能夠完全替代TLC法。HPLC法多是在反相色譜上對大環內酯類抗生素的有關物質進行檢測，TLC法則是在正相色譜上對被測物進行檢測。對于大環內酯類抗生素，因該類藥物的結構特點，若選擇HPLC法，其紫外檢測波長均在短波位置，在檢測時干擾較多，因此在2010年版《中國藥典》中，對該類藥物中的阿奇霉素和琥乙紅霉素有關物質的檢測仍選用TLC法進行。利用液相－質譜的聯用技術則可在使用色譜方法對有關物質進行分離的基礎上，進一步對有關物質的結構進行推測，更有利于全面掌握有關物質的信息。但必須解決好來自于色譜和質譜兩方面的問題，主要包括液相色譜液體流動相的去除，質譜靈敏度、穩定性的提高和質譜體積、成本的降低。CE法是目前研究較多的色譜新方法，該法沒有HPLC法中存在的傳質阻抗、渦流擴散等降低柱效的因素，縱向擴散也因毛細管壁雙電層的存在而受到抑制，因而能達到很高的理論板數及極好的分離效果，在經濟性、實用性等方面顯示了巨大的優勢。目前，將CE的高分辨率與質譜的高靈敏度相結合的最新聯用技術已得到初步發展，該儀器具有高柱效、高分辨率、高靈敏度及分析速度快的顯著特點。但由于質譜儀接口的限制，在氣相色譜－毛細管電泳法聯用時，只能用含有揮發性緩沖鹽的背景電解質，對氣相色譜法的分離效果有一定限制，因此成為目前此聯用技術亟待解決的問題。

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