7例散發性Creutzfeldt-Jakob病患者的PRNP和APOE基因突變/變異檢測及其臨床意義

羅 曼， 李驕星， 孫遜沙， 盛文利

Creutzfeldt-Jakob病簡稱CJD，其年發病率約為百萬分之一，是以快速進展性癡呆為特征，伴有小腦、錐體系和錐體外系受損癥狀和體征的神經系統變性疾病。本病的發病類型可分為散發性、家族性、醫源性和新變異型等4種形式，其中散發性CJD約占所有CJD的85%［1］。CJD是由一種特殊的具有感染性的蛋白質-朊蛋白(prion protein，PrP)所引起，而該蛋白由朊蛋白基因(prion protein gene，PRNP)編碼。另外，載脂蛋白E(apolipoprotein E，APOE)基因的ε4等位基因已被廣泛認可與阿爾茨海默病的發病有關，鑒于癡呆為CJD的主要臨床表現，國外學者對白種人CJD患者進行了APOE基因檢測，研究表明ε4等位基因可能也是CJD的危險因子［2］。本研究擬對中國漢族人群散發性CJD患者進行PRNP基因及APOE基因檢測，了解其突變/變異對散發性CJD發病及表型的影響。

1 對象與方法

1．1 對象 包括7例散發性 CJD患者，為2010年8月～2011年8月中山大學第一附屬醫院神經內科患者。男性4例，女性3例。發病年齡為52～76歲，平均62．0±8．2歲。7例患者均進行了詳細的內科及神經系統專科檢查，并進行了腦電圖、MRI、腦脊液14-3-3蛋白等輔助檢查。診斷參照WHO提出的 CJD診斷標準［3］，排除腦血管病、炎癥、腫瘤、外傷、代謝紊亂等疾病引起的癡呆，7例患者均診斷為很可能的(probable)CJD。全部患者無明確家族史，且均為中國漢族人群。

1．2 方法 抽取患者外周靜脈血4ml，置EDTA抗凝管中。血樣用血液基因組DNA提取試劑盒(北京TIANGEN公司)提取DNA，用核酸蛋白測定儀測定DNA純度及濃度，二者均合格后保存于－20℃冰箱中備用。參照文獻合成PRNP基因開放閱讀 框 架 引 物［4］(F:5’-CAGAGCAGTCATTATGGCGAACCT-3’，R:5’-AGACCTTCCTCATCCCACTATCAG-3’)及 APOE 基因第四外顯子引物［5］(F:5’-AACAACTGACCCCGGTGGCG-3’，R:5’-ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC-3’)，引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。以基因組DNA為模板，應用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增基因片段。PCR反應體系為25μl，其中包括:DNA模板1μl，上、下游引物(20pmol/μl)各 0．25μl，10 × PCR buffer 2．5μl，dNTP(2．5mmol)2μl，Taq 酶(5U/μl)0．2μl，滅菌雙蒸水 18．8μl。PCR 反應條件為:94℃ 預變性5min，94℃變性 30s，58℃ 或 65℃ 退火 30s，72℃ 延伸1min，共30個循環，最后72℃再延伸10min。PRNP基因退火溫度為65℃，APOE基因為58℃。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，溴化乙錠染色。目的產物送廣州贏森生物科技有限公司測序。

2 結果

2．1 PRNP基因測序 發現1例患者(病例1)存在PRNP基因E200K雜合突變(G598A)，經反向測序證實。結果(見圖1)。病例1臨床特點為:女性，58歲發病，亞急性起病，進展迅速。以記憶力減退及失語為首發癥狀，認知功能障礙進行性加重并逐漸出現小腦癥狀(頭暈、行走不穩)、錐體外系癥狀(四肢不自主運動)、肌陣攣、緘默。病程2個月時出現意識障礙并逐漸加重。頭部MRI示雙側扣帶回、雙側丘腦等T1、T2長信號，腦干、小腦未見異常。腦電圖示廣泛性中波幅慢波，左側顳區、額區間斷性類周期性癲癇樣放電，有時可波及到同側其他導聯。送廣東省疾控中心檢測腦脊液14-3-3蛋白(+)。發現6例患者PRNP基因M129V多態性(A385G)均為129基因型MM，僅1例患者(病例2)為129基因型MV，結果(見圖2)。未發現國外報道［6］的可能與CJD致病相關的位點突變(G114V、R148H、D178N、V180I、T183A、H187R、T188K、E196K、V203I、R208H、V210I、E211Q、M232R、P238S)。

圖1 病例1的PRNP基因測序結果示E200K雜合突變(G598A)

圖2 PRNP基因M129V多態性測序結果

2．2 APOE基因測序 發現1例患者(病例3)存在 APOE基因 ε4等位基因，基因型為 E3/4(ε3ε4)，其余6例患者都未檢測到該多態性，即基因型為E3/3(ε3ε3)。病例3臨床特點為:男性，52歲發病，亞急性起病，進展迅速。以小腦癥狀(頭暈、行走不穩)為首發癥狀，1w后出現進行性加重的認知功能障礙，并逐漸出現錐體外系癥狀(四肢不自主運動)、肌陣攣、緘默。病程1個月余即出現意識障礙并逐漸加重。頭部MRI+DWI示雙側額顳頂皮層DWI不對稱信號增強，腦皮層及小腦萎縮。腦電圖示中重度異常，未見周期性放電。送廣東省疾控中心檢測腦脊液14-3-3蛋白(+)。

3 討論

3．1 PRNP基因致病性突變檢測 人類PRNP基因位于20號染色體短臂，共約20kb堿基。它包含2個外顯子，第一外顯子為非編碼外顯子，第二外顯子含有795bp的開放閱讀框架。現有研究表明，散發性CJD的臨床病理及分子表型在很大程度上會受到PRNP基因變異的影響［7］。國外已報導的位于PRNP基因的CJD致病性突變包括:G114V、R148H、D178N、V180I、T183A、H187R、T188K、E196K、E200K、V203I、R208H、V210I、E211Q、M232R、P238S 等，本研究對7例散發性CJD患者進行了上述位點的檢測，結果發現1例患者(病例1)存在PRNP基因E200K雜合突變(G598A)，未發現其他位點突變。

E200K是全球范圍內PRNP基因的最常見突變，它是200位密碼子由GAG突變為AAG，導致谷氨酸(Glu，E)改變為賴氨酸(Lys，K)。該突變最先在斯洛伐克鄉村的CJD群集病例中發現［8］，幾乎同時，利比亞的一個患病猶太家庭也被檢測出了該突變［9］。目前，已有超過10個國家在CJD患者中發現了該突變，該突變的臨床表型除了常具有嚴重的睡眠障礙外，總體來說與散發性CJD相似，而睡眠障礙可能與該突變常伴發顯著的丘腦損傷有關。2010年，Gao等［10］報道了我國首例E200K突變的CJD患者，該例患者同樣以睡眠障礙為典型臨床表現，除此之外與散發性CJD無異。次年，中國疾病預防控制中心［11］對2006年～2010年中國克雅氏病監測網絡獲得的散發性CJD患者特點進行了總結，在所診斷的284例CJD患者中，僅發現1例E200K突變患者，即2010年Gao等所報道的病例。本研究所發現的該例E200K突變患者也具有與散發性CJD相似的特點，如發病年齡、進展性癡呆、小腦癥狀、錐體外系癥狀、肌陣攣、EEG及MRI改變、腦脊液14-3-3蛋白陽性等，這與以往報道相一致［6，10，12］，但其睡眠障礙并不明顯，我們考慮有以下可能:(1)雖然該患者影像學檢查也顯示雙側丘腦損害，但可能在早期損害較輕，未顯示明顯的癥狀;(2)早期的智能障礙部分掩蓋了睡眠障礙癥狀;(3)迅速出現的意識障礙掩蓋了睡眠障礙癥狀。另外，雖然其家族成員均無CJD患者，但由于其出現了致病性突變，仍應歸為家族性CJD，我們將聯系其子女進行基因檢測并追蹤其家族成員的發病情況。

3．2 PRNP基因多態性檢測 以往研究顯示，PRNP基因M129V是與CJD易感性相關的多態性位點［6］。M129V(A385G)多態性是指 PRNP 基因第129位密碼子可以為編碼甲硫氨酸(Met，M)的ATG，也可以為編碼纈氨酸(Val，V)的 GTG。在正常高加索人群中，37%的人群為 Met/Met(MM)，51%為 Met/Val(MV)，只 有 12%為 Val/Val(VV)［13］。多個研究均顯示，該位點 MM 型與 CJD易感性相關，在散發性CJD患者中，MM型所占的比例可以達到70% ～80%［14，15］;在E200K突變所致的家族性 CJD中，MM型也顯示與 E200K突變相關［6］。本研究所檢測的7例CJD患者中共6例為MM型，所占比例高達85．7%。即使去除診斷為家族性CJD的病例1，剩余的6例患者中MM型所占比例亦達到83．3%，這與國外的報道一致，也與以往針對中國散發性CJD患者的研究結果一致［11］。

3．3 APOE基因多態性檢測 人類APOE基因位于19號染色體長臂，由299個氨基酸組成，包含4個外顯子和3個內含子。最常見的APOE多態性為ε2/ε3/ε4等位基因多態性，該多態性的分子學基礎為氨基酸序列112位半胱氨酸(Cys)與158位精氨酸(Arg)互換。ε2在這兩個位置均為Cys，ε4則均為Arg，ε3分別為Cys和Arg。這3種等位基因導致了人群中存在6種不同的基因型，即3種雜合子(E2/3、E3/4、E2/4)和3 種純合子(E2/2、E3/3、E4/4)，其中ε3和E3/3是最常見的等位基因和基因型［16］，而 ε4等位基因已被廣泛認可與癡呆有關。鑒于癡呆為CJD的主要臨床表現，我們對CJD患者進行了APOE基因多態性檢測，結果發現僅1例患者為E3/4(ε3ε4)基因型，其余6例均為E3/3基因型。該例E3/4基因型患者為所有患者中發病年齡最小(52歲)、疾病進展最快、癥狀較重的，有別于其他E3/3基因型患者。國外學者曾對CJD患者進行了APOE基因多態性及腦內β-淀粉樣蛋白(Aβ)檢測，結果發現ε4等位基因與腦內Aβ沉積相關，故得出ε4等位基因是加速CJD進展的危險因子的結論［2］。這可以幫助解釋本研究中E3/4基因型患者發病早、進展快的現象。

本研究結合既往的研究結果表明，PRNP基因E200K突變為CJD致病性突變，129基因型MM多態性與散發性CJD易感性相關。本研究將1例E200K突變的家族性CJD患者誤診為散發性CJD患者，鑒于兩者在臨床表現的相似性，對CJD患者進行常規PRNP基因檢測將有助于兩者的鑒別，進而有助于對患病家系成員進行早期診斷。然而，由于本研究病例數較少，尚不能肯定APOE基因ε4等位基因對散發性CJD進展的影響確實存在，我們將在今后的工作中進一步加大樣本量。

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