非小細胞肺癌VEGF-C的表達及LYVE-1標記的微血管密度與淋巴結轉移的關系

劉東華 (內蒙古醫科大學附屬醫院保健中心，內蒙古 呼和浩特 010050)

肺癌的發病率和死亡率居惡性腫瘤的首位，淋巴結轉移是導致患者無法手術徹底切除和預后差的最重要原因之一，但其發生機制仍不清楚。

血管內皮生長因子(VEGF-C)是與腫瘤淋巴管生成和淋巴轉移相關的重要因子。研究表明，腫瘤患者表達的VEGF-C與腫瘤的淋巴結轉移密切相關。本研究旨在探討NSCLC患者VEGF-C蛋白的表達及內皮透明質酸受體(LYVE-1)標記的微血管密度與淋巴結轉移的關系及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2008年6月至2009年12月本院手術治療的56例NSCLC組織作為研究對象，所有患者均經過病理學檢測，手術前均沒有進行化療或者放射性治療。56例NSCLC患者中男39例，女17例，年齡36～74〔平均(56.25±10.48)〕歲。根據國際抗癌聯盟制訂的NSCLC TNM 分期:Ⅰ期9例，Ⅱ期4例，Ⅲ期21例(包括Ⅲa期18例以及Ⅲb期3例)，Ⅳ期為2例。病理類型:鱗癌24例，腺癌29例，大細胞癌3例。所有患者進行淋巴結轉移分析，其中43例有轉移，13例未出現轉移。對照組10例均為肺良性病變，男7例，女3例;年齡32～75〔平均(51.13±8.26)〕歲;肺大皰3例，肺錯構瘤2例，肺外傷6例。

1.2 免疫組化染色 所有患者的病變組織首先進行石蠟包埋，然后進行5 μm連續切片，再行HE以及免疫組織化學染色。VEGF-C單克隆抗體以及LYVE-1單克隆抗體(羊抗人)均購自美國R＆D，VEGF-C、LYVE-1表達水平的分析采用免疫組化試劑盒(購自北京中杉公司)。LYVE-1和VEGF-C石蠟切片分別采用檸檬酸緩沖液以及EDTA緩沖液進行高溫修復。最后用DAB顯色，蘇木精進行復染。

1.3 結果判定 免疫組織化學染色分析VEGF-C蛋白應位于腫瘤細胞及巨噬細胞的胞質中，呈棕黃色顆粒。結果判定按Mattern法〔1〕:根據細胞染色強度和染色細胞所占面積積分之和來判斷。染色強度積分:不染色=0;輕度染色(淡黃色)=1;中度染色(黃色)=2;強染色(棕黃色或黃褐色)=3。染色面積積分:無細胞染色=0;＜25%細胞染色=1;25% ～50%細胞染色=2;＞50%細胞染色=3。兩種積分之和≥3分者為表達陽性;≤2表達陰性。LYVE-1蛋白主要存在于淋巴管內皮細胞的胞質中，呈棕黃色顆粒。LMVD計數根據Wendner的方法進行〔2〕，即:先在低倍鏡下對整個切片進行分析，尋找血管最為密集處，然后再在高倍鏡下對染色的淋巴血管進行計數，分別選取4個視野計算血管數量，然后求平均值即為LMVD。

1.4 統計學方法 采用SPSS13.0進行統計分析。計量數據采用±s表示，組間比較采用t檢驗，計數資料進行χ2檢驗。

2 結果

2.1 VEGF-C、LYVE-1在病變組織的表達情況 NSCLC患者病變組織中VEGF-C蛋白表達陽性者為76.79%(43/56)，明顯高于肺良性病變組織30.00%(3/10)(P＜0.05)。LYVE-1在10例良性肺病變及56例NSCLC病變組織中均呈陽性，LYVE-1陽性血管主要分布于腫瘤邊緣，在腫瘤內部較少。LYVE-1陽性染色淋巴血管腔壁較薄，由單層內皮細胞組成，具有毛細血管的特點;內皮細胞的胞質中含有大量棕黃色的陽性顆粒，血管管腔內偶爾會出現瘤栓，但是沒有紅細胞。NSCLC組織中MLVD(11.19±1.54)較肺良性病變組織LMVD(6.05±1.26)增多(P＜0.05)。

2.2 VEGF-C表達與LYVE-1標記淋巴管密度的關系 VEGF-C表達陽性組MLVD(11.62±2.15)顯著高于LEGF-C陰性組 MLVD(9.76±1.36)(n=13，P＜0.05)。

2.3 VEGF-C表達與淋巴結轉移、PTNM分期的關系 NSCLC伴淋巴結轉移者VEGF-C蛋白陽性率為95.45%(21/22)，無淋巴結轉移者VEGF-C陽性率為67.65%(23/34)，差異有統計學意義(P＜0.05)。VEGF-C蛋白在Ⅰ期+Ⅱ期NSCLC患者中的陽性率為63.64%(21/33例)，在Ⅲ期+Ⅳ期NSCLC患者中的陽性率為100%(23/23)，兩組差異顯著(P＜0.05)。

3 討論

淋巴管轉移是NSCLC常見且主要的擴散途徑，是影響NSCLC患者預后的重要因素。目前認為，淋巴管生成受淋巴管生成因子及其受體的介導和調控。VEGF-C是淋巴管內皮生長因子，其是VEGF家族成員之一，其受體為VEGFR-3，VEGF-C與其受體結合后激活下游的信號通路進而促進淋巴管內皮細胞大量增殖和增生;同時，VEGF-C被水解后可轉化為其成熟形式，可激活VEGF-2進一步激活血管以及淋巴管內皮細胞。目前研究顯示，VEGF-C高表達腫瘤淋巴血管的形成以及密度，進而促進了腫瘤的淋巴轉移，因此認為其過表達與腫瘤患者的預后關系密切〔3～5〕。本研究結果顯示，NSCLC組織中VEGF-C的表達水平顯著高于肺良性病變組織，說明VEGF-C的過表達與NSCLC的發生以及進展有密切關系。在正常組織中，VEGF-C及其受體處于失活狀態，而在病理狀態下NSCLC細胞自分泌VEGF-C，促進腫瘤淋巴管的形成，進而促進腫瘤發展。

LYVE-1是一種膜蛋白，主要分布于淋巴管內外腔表面。目前研究顯示，LYVE-1在人和鼠正常以及腫瘤組織的淋巴血管中呈特異性表達〔6〕。汪源等〔7〕研究顯示，無論正常組織還是腫瘤組織的淋巴管內皮細胞中LYVE-1均表達陽性。本研究結果顯示，腫瘤組織中LYVE-1的表達水平顯著高于肺良性病變組織。VEGF-C表達陽性的組織中，MLVD顯著高于陰性組織。提示NSCLC細胞通過自分泌產生VEGF-C，與其受體結合激活下游信號通路促進淋巴管形成，淋巴管數目增多使癌細胞接觸淋巴管的機會增多，由于淋巴管缺乏緊密連接和連續的基底膜，腫瘤細胞易于從內皮細胞間隙進入淋巴管，從而促進肺癌淋巴結轉移。另一方面，VEGF-C可作為一種趨化因子活化淋巴管，誘導淋巴內皮細胞分泌趨化因子及類似物，趨化腫瘤細胞進入淋巴管，有利于腫瘤細胞通過間質液的流動被動轉運到淋巴管，發生淋巴轉移。VEGF-C表達增高、淋巴管密度增加是促使NSCLC發生淋巴結轉移的重要原因。本研究結果提示VEGF-C過表達促進了腫瘤淋巴結轉移以及預后不，與腫瘤的惡性程度明顯相關。通過抑制腫瘤細胞自分泌VEGF-C或者阻斷VEGF-C以及下游的信號通道，可抑制腫瘤淋巴血管的形成，并降低淋巴結轉移的發生率，對患者的預后有著重要意義。

1 Mattern J，Koommagl R，Voim M.Biological characterization of subgroups of squamous cell lung carcinomas〔J〕.Clin Cancer Res，1999;5(6):1459-63.

2 鄭亞民，達明緒，趙紫罡，等.胃癌癌周微淋巴管密度與腫瘤侵襲轉移的相關性研究〔J〕.華西醫學，2006;21(2):269-71.

3 Hirakawa S，Brown LF，Kodama S，et al.VEGF-C induced lymphangiogenesis in sentinel lymph nodes promotes tumor metastasis to distant sites〔J〕.Blood，2007;109(3):1010-7.

4 Karkkainen MJ，Haiko P，Sainio K，et al.Vascular endothelial growth factor C is required for sprouting of the first lymphatic vessels from embryonic veins〔J〕.Nat Immunol，2004;5(1):74-80.

5 Yonemura Y，Endo Y，Tabata K，et al.Role of VEGF-C and VEGF-D in lymphangiogenesis in gastric cancer〔J〕.Int J Clin Oncol，2005;10(5):318-27.

6 Vainionpaa N，Biitzow R，Hukkanen M，et al.Basement membrane protein distribution in LYVE-1 immunorcactive lymphatic vessels of normaltissues and ovarian carcinomas〔J〕.Cell Tissue Res，2007;328(2):317-28.

7 汪 源，潘鐵成，陳 濤.非細胞肺癌(NSCLC)的LYVE-1陽性微淋巴管密度與腫瘤淋巴轉移的關系〔J〕.現代腫瘤醫學，2009;17(7):1243-5.