多指標綜合優化疏乳消塊方的提取工藝

劉蘭萍，段好剛，魏玉輝，李波霞，秦紅巖，武新安

(蘭州大學第一醫院藥劑科，甘肅蘭州730000)

疏乳消塊方劑由柴胡、當歸、香附、元胡等中藥組成，具有疏肝解郁、軟堅散結之功效，用于治療乳腺增生、乳痛等癥［1］。該制劑是蘭州大學第一醫院協定處方，臨床應用40多年已取得了較好的臨床療效。前期實驗表明，疏乳消塊方的藥效部位主要是水提物部分。為了對其進行新制劑研發，本實驗以干膏得率、阿魏酸含有量、正丁醇萃取物含量為指標，采用L9(34)正交試驗法對疏乳消塊方最佳水提取工藝進行優選。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT二元梯度泵，SPD-M20A二極管陣列檢測器，DGU-20A在線脫氣系統，SIL-20A自動進樣系統，CTO-20A柱溫箱，LC solution色譜工作站(島津，日本)，ARA520電子分析天平(美國，Ohaus公司)。

阿魏酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110773-200611)，甲醇為色譜純(美國，Dikam公司)，其他試劑均為國產分析純。去離子水(蘭州大學第一醫院自制)。當歸，柴胡，元胡等十一味藥材均購自甘肅天森天水中藥飲片廠，經蘭州大學藥學院生藥學教研室專家鑒定，均為2010年《中國藥典》收載品種。

2 實驗部分

2.1 正交試驗設計依據前期的實驗基礎，確定疏乳消塊處方的藥效部位為水溶性部分，因此設計提取溶媒為水。在此基礎上，根據有關資料及初步預試結果，確定加水總倍數、提取時間、提取次數為主要影響因素，采用L9(34)正交表進行試驗，因素水平表見表1。鑒于加水總倍量較多，為了便于大工業生產濃縮，根據處方藥材的吸水量及預實驗結果，本實驗對不同提取次數加入的溶媒的倍量進行了重新分配，具體分配方法見表2。

表1 因素-水平Tab.1 Levels of orthogonal factor

表2 水煎分次提取溶媒分配Tab.2 Distribution list of dissolvant

2.2 提取方法按比例稱取處方藥材(除鱉甲外)50 g，共稱取9份樣品，置于回流提取裝置中，按照正交表安排進行提取操作，趁熱過濾(100目篩)，合并提取液，減壓濃縮至約90 mL，轉移至100 mL量瓶中，加水定容至刻度，作為供試品母液。

2.3 水提物收膏率的測定［2］精密量取上述供試品母液25 mL，置干燥恒定質量的的蒸發皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h，取出至干燥器中冷卻30 min、迅速精密稱定，計算水提取物收率。

2.4 阿魏酸測定

2.4.1 色譜條件色譜柱:C18ODS柱(5 μm，4.6 mm×150 mm，大連依利特);流動相:甲醇-1%醋酸(30∶70);檢測波長為322 nm;體積流量為1.0 mL/min。在上述色譜條件下，阿魏酸色譜圖見圖1。

圖1 阿魏酸對照品(A)、陰性對照樣品(B)和水提液樣品(C)HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of standard reference of ferulaic acid(A)，negative samp le(B)and samp le of water-extraction(C)

2.4.2 標準曲線的繪制精密稱取阿魏酸對照品5.0 mg，置于10 mL量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成500 μg/mL的對照品貯備液。將該貯備液進一步稀釋成質量濃度為0.98～250 μg/mL的系列對照品溶液，用0.45 μm微孔濾膜過濾后，分別進樣10 μL進行分析，記錄峰面積，以阿魏酸的質量濃度為X軸，峰面積為Y軸進行線性回歸，得回歸方程:Y=52 932X－34 360，r2=0.999 6，表明阿魏酸在0.98～250 μg/mL范圍內峰面積與質量濃度呈良好的線性關系。

2.4.3 精密度試驗分別配制高、中、低3個質量濃度(200、31.25、1.96 μg/m L)的對照品溶液，分別于日內不同時間進樣測定5次，連續5日內進樣5次，計算含量，其日內、日間RSD分別小于0.36%和0.78%，表明方法的精密度良好。

2.4.4 重復性試驗精密量取2.2項下的供試品液6份，按上述色譜條件測定阿魏酸峰面積，計算阿魏酸的量，6份樣品測定的RSD均小于1.5%，表明本方法重復性良好。

2.4.5 穩定性試驗取2.2項下的供試品液在0、2、4、6、8 h分別進樣10 μL測定，結果峰面積的RSD為2.2%，表明供試品溶液在8 h內穩定性良好。

2.4.6 樣品測定精密吸取上述提取供試品液0.5 mL，加甲醇0.5 mL，渦旋混勻1 min后，10 000 r/min離心5 min，上清液過0.45 μm微孔濾膜后，進樣10 μL進行分析，記錄峰面積，計算阿魏酸的量。

2.5 正丁醇萃取物含有量的測定精密量取上述供試品液20 mL，加水飽和的正丁醇20 mL振搖提取，靜置使分層，分取正丁醇層，置干燥恒定質量的蒸發皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h，取出至干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定，計算正丁醇萃取物收率。

3 結果

3.1 水提得膏率正交分析計算水提得膏率結果后，正交分析結果見表3，方差分析結果見表4。

表3 水提取工藝L9(34)正交分析Tab.3 Results of L9(34)orthogonal experiments

表4 水提收膏率方差分析結果Tab.4 ANOVA results of the extraction yield w ith water

由表3極差分析可知，各因素對水提得膏率的影響大小順序為C＞B＞A，直觀分析得提取最佳工藝為A3B3C3。由表4方差分析結果可知，B因素(提取時間)及C因素(提取次數)對得膏率有顯著性影響(P＜0.05)，故選B3C3，而A因素(加水總倍量)對得膏率無顯著性影響，故可任選，根據直觀分析，A3＞A2＞A1，最佳工藝為A3B3C3，即水煎提取3次，加水量分別為7倍、6倍、3倍，每次提取2 h。

3.2 阿魏酸含有量正交結果分析阿魏酸含有量正交結果見表3，方差分析結果見表5。由表3可以看出，各因素對阿魏酸含有量的影響大小順序為C＞B＞A，直觀分析得提取最佳工藝為A2B3C3，即水煎提取3次，加水量分別為6倍、5倍、3倍，每次提取2 h。由表5方差分析結果可知，各因素對阿魏酸的量均無顯著性影響。

表5 阿魏酸含有量方差分析結果Tab.5 ANOVA results of the content of ferulaic acid

3.3 正丁醇萃取物含量正交結果分析正丁醇萃取物收率正交分析結果見表3，方差分析結果見表6。由表3可知，各因素對正丁醇提取物收率的影響大小順序為A＞C＞B，直觀分析得最佳提取工藝為A2B2C3。由方差分析結果可知，A因素和C因素對實驗結果有顯著性影響(P＜0.05)，B因素對實驗結果無顯著性影響，故可任意選擇，根據直觀分析，C3＞C1＞C2，故選擇C3，最佳工藝為A2B2C3，即水煎提取3次，加水量分別為6倍、5倍、3倍，每次提取1.5 h。

表6 正丁醇萃取物含有量方差分析結果Tab.6 ANOVA results of the content of n-butanol extraction

3.4 綜合分析方差分析結果顯示，在所選指標與因素中，因素B及因素C對水溶性成分的提取效果有顯著性影響，因素A無顯著性影響。由于阿魏酸及正丁醇萃取物均為極性較大的成分，且水溶性相對較好，較易提出，綜合直觀分析結果，因素B及因素C對水溶性成分的提取效果有一定的影響，結合提取效率與提取成本，最終優選的最佳工藝為A2B3C3，即水煎提取3次，加水量分別為6倍、5倍、3倍，每次提取2 h。

3.5 驗證試驗按比例稱取十一味處方藥材(除鱉甲外)50 g，共6份樣品，按照正交試驗結果優選確定的最佳工藝提取，即水煎提取3次，加水量分別為6倍、5倍、3倍，每次提取2 h，合并濾液，濃縮定容至100 mL，取樣依法測定浸膏出膏率、阿魏酸質量分數及正丁醇萃取物收率，結果見表7。

表7 驗證試驗結果Tab.7 Results of verification test

4 討論

疏乳消塊方全方由十二味藥材組成，其鱉甲主要化學成分為氨基酸、動物膠、角蛋白、碘質、維生素D等［3］，采用煎煮法提取有效成分不易提出，且容易發生變化，因此只對其中十一味藥材進行正交試驗優選提取方法。柴胡與當歸為方中主藥，故選取阿魏酸及正丁醇萃取成分作為指標性成分研究疏乳消塊方的最佳提取工藝。

在考察溶媒總倍量時，一般的正交試驗在多次提取時，多采用加入一定倍量的溶媒提取多次，會造成提取液的總量過大，在大工業生產時給濃縮步驟帶來不便。本實驗根據處方藥材吸水量情況及預實驗結果，結合提取效率，在多次提取時，對溶媒總倍量進行了重新分配，結果顯示溶媒總倍量重新分配后的提取方法在對一些指標性成分的提取效果上沒有明顯差異，且減少了提取液的總量，有助于減少濃縮時間，更符合工業生產的要求。

多指標優選中藥復方工藝是提高中藥制劑質量的重要手段，符合中藥復方中多組分，多靶點的作用特點，能更合理的評價整個工藝過程，已被廣泛應用于中藥復方的工藝研究［4-8］。目前，中藥提取工藝綜合評價中常用的經驗性權數法，它是由專家或主研者根據評價指標的重要性來確定權重系數，主觀因素影響較大。本實驗對各指標結果單獨進行分析，根據分析結果并結合提取效率及提取成本，最終確定最佳提取工藝，驗證實驗結果表明，優選的工藝各指標性成分的含量較高，工藝合理，可行。

［1］何華，張玉春，焦凱.HPLC測定疏乳消塊丸中阿魏酸的含量［J］.中成藥，2005，27(8):983-984.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版了部［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄XA.

［3］江蘇新醫學院.中藥大辭典(下冊)［M］.上海:上?？萍汲霭嫔纾?986:2723.

［4］任愛農.多指標綜合評分法優選清清顆粒提取工藝［J］.中成藥，2008，30(7):1059-1062.

［5］張倩，劉志宏，周欣，等.多指標正交試驗優化葛澤清肝膠囊的提取工藝［J］.中國醫院藥學雜志，2011，31(17):1432-1436.

［6］陳吉航，黃松，黃孟秋，等.多指標綜合評分法優選婦科栓劑的提取工藝［J］.中成藥，2010，32(3):508-511.

［7］康阿龍，張嫻，湯迎爽.多指標綜合評分法優選燒傷靈涂膜醇提取工藝［J］.中國實驗方劑學雜志，2010，16(11):18-20.

［8］張永太，施建國，馮年平，等.多指標綜合考察芪丹冠心舒微丸提取工藝［J］.中成藥，2011，33(1):57-60.