熱量限制對SH-SY5Y細胞氧化損傷的影響

陳 娟，張景燕，王 蓉，趙靜姝，郭 瑾，吳燕川，趙志煒

(1.首都醫科大學宣武醫院中心實驗室，北京老年病醫療研究中心，神經變性病教育部重點實驗室，北京 100053；2.中國人民解放軍總醫院301超聲診斷科)

神經退行性疾病的共同特征是特定區域神經元功能的喪失，即神經元的不可逆損傷、死亡。越來越多證據表明，氧化應激參與了神經退行性疾病的病理機制，在阿爾茨海默病、帕金森綜合癥、腦卒中等疾病中都發現了自由基增多導致的細胞損傷，增多的氧自由基能攻擊蛋白質、脂肪酸和脂質膜，從而破壞細胞的功能和完整性。因此，減少神經元內氧自由基的產生，對保護神經元、延緩衰老及對抗損傷有重要意義［1］。

熱量限制飲食在很多物種中能夠改善健康和延緩衰老，近年來大量研究發現，熱量限制飲食可以減少多種與年齡相關的疾病的發生［2］，但至今其延緩衰老的機制尚未十分清楚。有研究表明，熱量限制延緩衰老可能機制之一是抗氧化應激［3］。熱量限制大大降低了腦、心臟和肝臟中線粒體活性氧物質的產率，可能是延緩衰老進程的一個基本機制［4］。本實驗擬通過觀察低熱量培養對過氧化氫誘導的SH-SY5Y細胞氧化損傷的影響，為進一步探討熱量限制在氧化應激損傷中的保護機制打下基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株：人神經母細胞瘤株 SH-SY5Y細胞來自瑞典卡羅林斯卡醫學院。

1.1.2 試劑：噻唑蘭(MTT)購自 Sigma公司，二甲基亞砜(DMSO)購自北京亞太精細化工公司，乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒，購自北京化工廠，編號001012，30%過氧化氫購自北京化工試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與處理：細胞用 DMEM*F12(Gibco)培養基培養(3.0g/L-glucose)，加入10%胎牛血清、青霉素 100IU/m L、鏈霉素100IU/m L于37℃、5%CO2培養箱中培養。貼壁細胞生長密度達到70%～80%時，分組處理：對照組及損傷組，換用DMEM ×F12加入1%血清，培養24h；低糖組及低糖+損傷組，換用低糖組培養基為DMEM(2.0g/L-glucose)加1%胎牛血清，培養24h；予以250μmol/L的H2O2分別損傷1h和7 h。用于后續實驗。

1.2.2 MTT代謝率測定：將SH-SY5Y細胞接種于96孔板中，細胞接種密度1.0×104/孔，待細胞貼壁生長至70%～80%時予以相應處理，加入MTT溶液(5.0g/L)20uL繼續培養4h后，棄去培養液，每孔加入150μL DMSO作用10m in后，用全波長酶標儀(Multiskan Spectrum)測定570nm處光密度值。

1.2.3 細胞生長形態觀察：用倒置顯微鏡(Olympus產品)觀察培養的細胞，比較對照組和實驗組細胞的形態。

1.2.4 LDH漏出率測定細胞培養方法：同前，按照LDH試劑盒所示方法(比色法)，測定570nm處光密度值，同時做條圖。

1.3 統計學方法

用SPSS11.5軟件統計分析，資料數據以均數±標準差(±s)表示，組間差異顯著性檢驗用單因素方差分析(One Way ANOV)及重復資料的方差分析，P＜0.05認為差異有顯著性意義，P＜0.01認為差異有非常顯著性意義。

2 結果

2.1 MTT代謝率測定

不同濃度過氧化氫作用1h后，采用MTT法檢測細胞活力。結果顯示隨著過氧化氫濃度的增加，細胞活力呈遞減趨勢(圖1)。

圖1 不同濃度過氧化氫對細胞活力的影響注：與對照組相比＊＊P＞0.05；##P＜0.01。誤差條：±2sFig.1 Effect of different concentrations of hydrogen peroxide on the SH-SY5Y cells viabilityNote：＊＊P＞0.05，vs.control group；##P＜0.01，vs.control group

用250μmol/L過氧化氫分別處理1h和7 h，和對照組比較，低糖組活力明顯上升；與損傷組比較，低糖+損傷組活力上升(圖2)。

2.2 LDH漏出率測定結果

與空白組比較，損傷組漏出率明顯增加，P＜0.05，低糖組1h漏出率稍有減少，P＞0.05；與損傷組比較，低糖 +損傷組1h漏出率明顯減少，P＜ 0.01，繼續培養至7 h顯示，低糖組漏出率由(1.154±0.062)增加至(1.223±0.107)；低糖+損傷組漏出率由(1.128±0.542)增加至(1.262±0.081)，P＜0.01(圖3)。

圖2 熱量限制對過氧化氫損傷不同時間段的影響注：損傷1h，與空白組比較，*P＜0.01；與損傷組比較，*P＜0.01；損傷7 h，與空白組比較，＊＊P＜0.01；與損傷組比較，＊＊P＜0.01。誤差條：±2sFig.2 Effect of caloric restriction for different times on thehydrogen peroxide-induced cell damage Note：Damaged for 1hour，*P＜0.01，vs.control group；*P＜0.01，vs.H2 O2 group；damaged for 7 h，＊＊P＜0.01，vs.control group；＊＊P＜0.01，vs.H2 O2 group.

圖3 LDH漏出率測定注：圖3為過氧化氫損傷1h的細胞LDH漏出率。與空白組比較，*P＞0.05；與損傷組比較，＊＊P＜0.01。誤差條：±2sFig.3 The LDH leakage rates in the cells of different groupsNote：H2 O2-treated for 1hour.*P＞0.05，vs.control group；＊＊P＜0.01，vs.H2 O2 group

2.3 細胞形態學觀察

圖4、5、6(見彩插1)所示為各組細胞在不同處理時段的細胞形態。圖4為未加損傷之前，空白組、低糖組的細胞形態，各組細胞數目及形態與對照組比較無明顯改變。圖5為加入損傷藥物1h后的細胞形態與未加損傷錢比較無明顯改變，圖6為加入損傷藥物7 h后的細胞形態，低糖組和空白組細胞突起伸展良好細長，損傷組可見細胞數目明顯減少，死細胞多，細胞突起回縮，細胞明顯變圓，貼壁性不好，透光性差。

3 討論

熱量限制(caloric restriction，CR)是指一種有計劃的減少由食物提供的熱量的進食方式，一般指在生物體所攝入營養成分在保證其不發生營養不良的情況下，將正常自由進食所得的熱量減去30% ～50%。早在20世紀30年代，McCay等［5］人就發現限制食物的攝入就能延長嚙齒類動物的壽命。許多學者運用熱量限制的方法在從酵母到靈長類動物中發現了類似的結果［6］。在熱量限制的動物和志愿者，可以看到一個穩定的生理變化：較低的體溫、較低的血糖和胰島素水平、以及脂肪和體重的降低［7］、較強的應激耐受能力，包括熱應激和氧化應激。神經元衰老機制研究中，氧化應激是加速神經元衰老的主要原因之一，雖然神經元衰老的機制仍不是很清楚，但長期以來一直認為氧化應激、DNA損傷可能是神經元衰老的關鍵原因［8］。

本實驗觀察到在細胞生長至對數期后給予低糖預處理24h，過氧化氫損傷1h(短期)和7 h(長期)，MTT代謝率及LDH漏出率測定顯示低糖組活力較損傷組活力明顯增高，低糖組細胞形態維持良好，而損傷組細胞突觸回縮，形態變圓，懸浮細胞和死細胞增多，顯示低糖對短時間的急性氧化應激損傷和長期的氧化應激損傷都能起到一定的保護作用，這一結論與近年研究的熱量限制抗氧化損傷的結論相符［9］，低糖通過模擬熱量限制的作用，降低線粒體活性氧類物質的生成，上調相關解偶聯蛋白的表達，提高機體的抗氧化酶水平，使機體內活性氧類物質生成減少，清除提高，從而發揮很好的抗氧化損傷作用［10，11］；也提示我們，在日常生活中減少碳水化合物的攝入的比例有益于提高自身的抗氧化應激能力，保持身體健康，延緩衰老。總之，CR是一個生物體主動調節的過程，其延緩衰老的作用可能是通過促進線粒體增殖進而降低自由基水平來實現的［12］。本實驗為熱量限制抗氧化應激損傷提供了重要的理論依據。

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