2%氫氣生理鹽水對阿爾茨海默病大鼠海馬神經細胞的保護作用

周風華 呂世軍 (濰坊醫學院病理學教研室，山東 濰坊 261053)

2%氫氣生理鹽水對阿爾茨海默病大鼠海馬神經細胞的保護作用

周風華 呂世軍 (濰坊醫學院病理學教研室，山東 濰坊 261053)

目的 探討2%氫氣生理鹽水治療的阿爾茨海默病(AD)大鼠學習、記憶能力以及海馬神經元及神經膠質細胞的形態學變化的影響。方法 雄性SD大鼠，隨機分為正常對照組、生理鹽水治療組及2%氫氣生理鹽水治療組，每組各10只。按6 mg/kg腹腔注射三甲基錫(TMT)誘導AD大鼠模型。按10 m l/kg腹腔注射2%氫氣生理鹽水進行治療，生理鹽水治療組按同樣劑量進行注射。Morris水迷宮實驗檢測大鼠空間學習、記憶能力，尼氏染色觀察大鼠海馬神經元數量及尼氏小體的變化，免疫組織化學檢測caspase-3在海馬神經元的表達，電鏡觀察海馬神經元及膠質細胞超微結構的變化。結果 2%氫氣生理鹽水能顯著改善AD大鼠空間學習、記憶能力障礙，抑制caspase-3的表達活性，降低海馬神經元的凋亡，保護神經元，同時電鏡檢測顯示海馬神經元及膠質細胞的超微結構得到改善。結論 2%氫氣生理鹽水能夠改善海馬神經元及膠質細胞的超微結構，抑制細胞凋亡，保護神經組織，從而提示2%氫氣生理鹽水對AD有保護治療作用，其深層機制有待進一步探討。

阿爾茨海默病;三甲基錫;2%氫氣生理鹽水;caspase-3

阿爾茨海默病(AD)的發病有多種學說，其中膠質細胞的活化、炎癥反應及自由基的產生引起的神經元損傷是發病機制的重要環節。三甲基錫(TMT)是一種強效的神經毒劑，可引起邊緣系統尤其是海馬區神經元的損傷，從而導致學習及記憶功能的損害〔1〕，可作為研究AD的動物模型〔2〕。氫是自然界最簡單的元素，氫氣是無色、無嗅、無味、具有一定還原性的雙原子氣體。氫氣在生物體內具有抗氧化作用，目前已證實氫氣可治療多種疾病。本實驗探討2%氫氣生理鹽水對AD大鼠的治療保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物 成年 SD大鼠，30只，8周齡，雄性，180～200 g，SPF級，由山東省中醫藥大學提供，每籠5只，23℃ ～25℃，55%濕度，每天采光12 h，常規飲食飲水。

1.2 藥物及實驗試劑 TMT由廣東省職業病防治院唐小江教授惠贈，購自美國Acros organics，批號:12335301，常溫無菌生理鹽水溶解，4℃保存;2%氫氣生理鹽水由上海第二軍醫大學孫學軍教授惠贈，4℃密閉保存;甲苯胺藍購自美國Sigma公司;兔抗人多克隆抗體caspase-3，工作液，購自武漢博士德生物技術有限公司。

1.3 大鼠模型構建、分組及給藥 隨機選取20只大鼠，腹腔注射TMT無菌生理鹽水溶液(6 mg/kg)一次，誘導AD模型，另外10只作為正常對照組。20只大鼠隨機分為生理鹽水治療組、2%氫氣生理鹽水治療組，每組各10只，于TMT注射后2 h，按8 m l/kg的量分別腹腔注射生理鹽水及2%氫氣生理鹽水，連續2 w，前7 d上午、下午各一次，后7 d每天一次。

1.4 水迷宮實驗 對各組實驗大鼠，實驗期間進行水迷宮實驗，每天1次，共測7次，錄像，并對錄像進行分析，得出運動的平均潛伏期及運動軌跡，分別測量四個不同入水點的潛伏期。

1.5 標本采集 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛溶液灌注。迅速斷頭處死，取腦，10%中性甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，60℃溫箱浸蠟過夜，包埋框包埋，自然冷卻凝固。將石蠟包埋組織連續切片，厚5μm，待用。另分離部分海馬，將新鮮組織制成1 mm小塊，迅速浸入預冷的3%戊二醛中前固定，待做電鏡標本。

1.6 尼氏染色 切片脫蠟至水，1%的甲苯胺藍染液，60℃，2～3 min，蒸餾水沖洗，梯度酒精分化，無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察海馬CA3及CA4區神經元數量變化(放大400倍)，隨機選取10個高倍視野，進行細胞計數，取其平均值，并在顯微圖像分析系統中檢測神經元內尼氏小體的灰度變化，取其平均值。

1.7 免疫組織化學 切片脫蠟至水，3%H2O2去離子水孵育，PBS浸泡，微波抗原修復，自然冷卻至室溫，滴加封閉用正常山羊血清工作液37℃孵育，傾去，勿洗，滴加一抗caspase-3，以PBS代替一抗作為陰性對照，4℃過夜，室溫放置30 min，PBS沖洗，，滴加生物素標記山羊抗鼠IgG工作液，37℃孵育，PBS沖洗，滴加SP工作液，37℃孵育，PBS沖洗，DAB顯色，鏡下控制顯色時間，自來水終止反應，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察神經元的表達情況，拍照，圖像分析系統采集灰度值并分析。

1.8 電鏡 電鏡標本經醋酸雙氧鈾，枸櫞酸鉛染色。由濰坊醫學院形態學實驗中心電鏡室觀察。

2 結果

2.1 學習記憶能力 各組平均潛伏期分別為:正常對照組:(5.2 ±0.3)s，(5.3 ±0.6)s，(8.5 ±0.1)s，(6.4 ±0.2)s。生理鹽水治療組:TMT注射后的第3天，大鼠出現明顯的學習記憶能力的損傷，極少數大鼠能夠在1 min內找到平臺，潛伏期明顯延長，且不穩定，大多數大鼠在1 min內未能找到平臺。2%氫氣生理鹽水治療組:大鼠能找到平臺，但是潛伏期較正常對照組延長，分別為(19.6±0.5)s，(20.3±0.2)s，(28.5±0.6)s，(21.4 ±0.3)s。

2.2 尼氏染色 正常對照組，海馬神經元數量較多，尼氏小體豐富;生理鹽水治療組，海馬區尤其是CA3及CA4區部分神經元水腫部分神經元胞體內尼氏小體消失，細胞核固縮及溶解，較正常對照組神經元數量減少(P＜0.05);氫氣生理鹽水治療組較正常對照組神經元數量減少，但無顯著差異(P＞0.05)，較生理鹽水組神經元數量明顯增多(P＜0.05)。見表1，圖1。

2.3 免疫組織化學染色 免疫組織化學染色陽性表達部位在細胞核，呈棕黃色顆粒狀。正常對照組少數海馬神經元表達，灰度值為0.32±0.01;生理鹽水治療組，caspase-3陽性細胞數量增多，灰度值為0.76±0.05，與正常對照組差異顯著(P＜0.05);氫氣生理鹽水治療組，陽性細胞較生理鹽水治療組減少，灰度值為0.68±0.03，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表 1，圖 2。

表1 海馬CA3、CA4區神經元計數比較及caspase-3灰度值比較(±s)

表1 海馬CA3、CA4區神經元計數比較及caspase-3灰度值比較(±s)

與正常對照組比較:1)P＜0.05

組別 神經元計數23.6±0.71 0.32±0.01生理鹽水組 15.3±0.151) 0.76±0.051)氫氣生理鹽水治療組 21.4±0.51) 0.68±0.031)caspase-3正常對照組

圖1 各組尼氏小體(尼氏染色，×400)

圖2 各組大鼠海馬神經元caspase-3免疫組化表達(SP，×400)

2.4 電鏡觀察 生理鹽水治療組海馬神經元，表現為粗面內質網及游離核糖體數量減少，部分區域出現似板層狀顆粒結構，小膠質細胞及星形膠質細胞胞質電子密度降低，膠質細胞可見核周隙局部增寬;氫氣生理鹽水治療組，海馬神經元胞質內粗面內質網及游離核糖體較豐富，膠質細胞未見明顯異常。

3 討論

膠質細胞的活化、炎癥發生以及自由基的產生在AD發病中發揮了重要作用。小膠質細胞和星形膠質細胞的活化，可導致神經元損傷〔3〕。

氫氣在生物體內具有抗氧化作用，目前已證實氫氣可治療多種疾病。高壓氫氣可有效治療動物皮膚惡性腫瘤，并認為是通過抗氧化作用〔4〕。2001年，法國潛水醫學家證明，呼吸8個大氣壓高壓氫氣可治療肝曼森血吸蟲感染引起的炎癥反應，首次證明氫氣具有抗炎作用，并提出氫氣與羥自由基直接反應是治療炎癥損傷的基礎〔5〕。有人報道，動物呼吸2%的氫氣就可有效清除自由基，顯著改善腦缺血再灌注損傷，他們采用化學反應、細胞學等手段證明，氫氣溶解在液體中可選擇性中和羥自由基和亞硝酸陰離子〔6〕。早期治療可明顯改善新生兒腦缺血缺氧損傷晚期神經功能和學習記憶能力。上述研究表明，作為一種選擇性抗氧化物質，氫氣對某些疾病具有治療作用。

海馬CA3到CA1區椎體細胞的突觸連接對于空間學習及記憶能力的形成是非常重要的〔7〕。TMT是一種強效的神經毒性有機錫化合物，可顯著誘導大鼠海馬CA3區神經元的變性及壞死，從而導致空間學習及記憶功能的損害，誘導AD模型。大量研究表明，TMT誘導的神經元損傷與活性氧自由基及活性氮自由基的產生有關。TMT可引起腦組織中小膠質細胞及星形膠質細胞的增生，釋放大量的細胞因子(如IL-1、TNF-α等)誘發炎癥反應，同時體內產生大量的自由基〔8～10〕，自由基的產生損傷神經元，造成神經元的變性及壞死。

本實驗發現，TMT注射后的大鼠，其空間學習記憶能力明顯受損，caspase-3表達活性增強，海馬CA3及CA4區神經元出現核固縮現象，尼氏小體減少，海馬神經元及膠質細胞均出現了超微結構的改變。而經2%的氫氣生理鹽水同時治療后，學習記憶能力明顯改善，海馬神經元的數量明顯增加，尼氏小體數量增加，caspase-3的活性降低，抑制了海馬神經元的凋亡，并且膠質細胞的超微結構改善，能夠很好地治療TMT引起的AD，而氫氣對該模型神經元的保護作用是否與抗氧化有關目前尚未證實，這將是我們下一步工作的重點。

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R361

A

1005-9202(2012)16-3484-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.064

山東省教育廳課題(J12LK51)

呂世軍(1961-)，男，教授，博士，碩士生導師，主要從事神經病理學研究。

周風華(1977-)，女，講師，碩士，主要從事神經病理研究。

〔2011-03-14收稿 2011-07-10修回〕

(編輯 曹夢園)