苦參堿誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細胞凋亡及其對Bax表達的影響

王淑強 郭 穎 李海軍 張林西 李玉珍 郝秀輕 (河北北方學(xué)院病理教研室，河北 張家口 075000)

苦參堿誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細胞凋亡及其對Bax表達的影響

王淑強 郭 穎 李海軍 張林西 李玉珍 郝秀輕 (河北北方學(xué)院病理教研室，河北 張家口 075000)

目的探討苦參堿在體外誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細胞的凋亡作用及其機制。方法用MTT方法檢測乳腺癌MCF-7細胞生長抑制率，用流式細胞儀(FCM)分別檢測MCF-7細胞凋亡情況，MCF-7細胞線粒體跨膜電位及MCF-7細胞Bax蛋白表達情況。結(jié)果苦參堿對乳腺癌MCF-7細胞生長抑制率測定結(jié)果顯示，不同濃度的苦參堿對MCF-7細胞生長抑制率與對照組相比存在明顯差異(P＜0.05)，呈劑量-效應(yīng)正相關(guān)及時間-效應(yīng)正相關(guān)，流式細胞儀檢測MCF-7細胞凋亡，與對照組相比均有顯著差異(P＜0.05)，隨著苦參堿濃度的增高，凋亡的發(fā)生率也相應(yīng)提高，呈正相關(guān)。線粒體跨膜電位檢測，苦參堿處理組MCF-7細胞羅丹明染色陽性數(shù)明顯低于對照組，存在顯著差異(P＜0.05)，并隨苦參堿濃度的增高而減少，呈負相關(guān)。流式細胞儀檢測Bax蛋白表達顯示，Bax蛋白表達上調(diào)，與對照組相比，存在顯著差異(P＜0.05)，且隨作用濃度增高表達增強，呈正相關(guān)。結(jié)論中藥苦參堿在體外能抑制乳腺癌MCF-7細胞之生長抑制，并能誘導(dǎo)該細胞凋亡。

苦參堿;細胞凋亡;MCF-7cells;體外誘導(dǎo)

苦參堿是從傳統(tǒng)中藥中分離出的一種生物堿，是中藥苦參的主要有效成分，屬于四環(huán)的喹諾里丙啶類。大量的藥理和臨床研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿具有抗炎，抗病毒，抗纖維化，免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用〔1〕。近年來，有人發(fā)現(xiàn)苦參堿還具有抗腫瘤的作用，可抑制腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移，促進凋亡，誘導(dǎo)腫瘤分化，對肝癌、肺癌、胃癌、大腸癌、食管癌和乳腺癌等多種癌細胞具有抑制作用〔2，3〕。本研究探討苦參堿對乳腺癌MCF-7細胞的抑制和誘導(dǎo)細胞凋亡作用及對凋亡抑制基因Bax表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 苦參堿購自北京雙鷺藥業(yè)股份公司，乳腺癌細胞株MCF-7由我院中心實驗室提供，RPMI-1640培養(yǎng)液，細胞凋亡羅丹明123染色試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，新生胎牛血清購自天津市川頁生化制品有限公司。胰酶、四甲基噻唑藍MTT購自北京普京康生物工程有限公司。FITCBax蛋白抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，SW-GJ-2FD型超凈工作臺，3319型CO2培養(yǎng)箱，BDFACS-Aria流式細胞儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及傳代 將凍存的乳腺癌細胞株MCF-7，從－176℃ 液氮罐中取出，快速放入37℃ ～42℃左右水浴箱中快速解凍，融化后將凍存管置于離心機離心，1 500 r/min，離心7 min，將離心后的凍存管在超凈臺內(nèi)打開，棄去凍存液后加入2 ml配置好的RPMI-1640培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打懸浮細胞后將培養(yǎng)液移入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液加至4～5 m l，放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。細胞培養(yǎng)24 h后，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，細胞占瓶底80%左右即可進行傳代培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液后加入消化液約2 m l左右進行消化，在倒置顯微鏡下觀察，細胞開始收縮細胞間出現(xiàn)裂隙，尚未完全變圓前，即可終止消化，棄去消化液后加入新鮮培養(yǎng)液，輕輕吹打貼壁細胞，直到完全懸浮后，均分移入培養(yǎng)瓶內(nèi)進行細胞培養(yǎng)，然后繼續(xù)在37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。

1.2.2 苦參堿對MCF-7細胞生長抑制率MTT實驗方法 取對數(shù)期生長的乳腺癌MCF-7細胞，用0.25%胰酶消化加培養(yǎng)液輕輕吹打懸浮細胞，將濃度調(diào)到2×104個/ml，每孔100μl接種于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h，觀察細胞貼壁且生長良好后，分別加入 100μl苦參堿溶液使其濃度分為 0.25、0.5、1.0、2.0 mg/m l作為實驗組，另外加入與實驗組等量的培養(yǎng)液作為對照組，各設(shè)4個復(fù)孔。37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育。苦參堿作用24、46、72 h后進行MTT檢測，檢測前每孔加入100μl DMSO，輕輕振蕩，溶解約10～15 min后，用酶標儀測定吸光度。選擇492 nm測量波長。計算出每個時間段中對照組與實驗組4個復(fù)孔的平均吸光度值，代入下列公式計算。計算公式:腫瘤細胞生長抑制率(%)=(1－實驗組吸光度/對照組吸光度)×100%。上述實驗重復(fù)三次，進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

1.2.3 細胞凋亡的檢測 取實驗組和對照組細胞，棄去培養(yǎng)液，胰酶消化，加預(yù)冷的PBS洗滌，輕輕吹打貼壁細胞使之懸浮。收集細胞于尖底離心管內(nèi)離心(1 500 r/min，7min)并調(diào)整細胞數(shù)為1×105個，相同方法PBS洗滌兩次，兩次離心前先將細胞移入流式測定管內(nèi)，離心后流式測定管內(nèi)加入100μl結(jié)合緩沖液懸浮細胞，相繼加入5μl Annexin V/FITC和10μl碘化丙啶溶液(20μg/ml)，混勻后室溫下避光孵育15 min，加入400μl結(jié)合緩沖液及時上流式細胞儀分析。

1.2.4 線粒體跨膜電位的檢測 選取對數(shù)生長期MCF-7細胞5瓶，選取其中4瓶分別加入含培養(yǎng)液的苦參堿4 ml，苦參堿濃度分別為0.25、0.5、1.0、2.0 mg/ml為實驗組，取1瓶加入等量培養(yǎng)液為對照組。細胞37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h。藥物作用24 h后細胞經(jīng)0.25% 胰酶消化重懸于培養(yǎng)液中，取細胞數(shù)為1×106個/m l，加入羅丹明123染液10μg/ml 37℃5%CO2培養(yǎng)箱孵育20 min離心，培養(yǎng)液洗細胞兩次，上流式細胞儀檢測。

1.2.5 Bax蛋白的檢測 實驗分24 h和48 h組，均隨機自選對數(shù)生長期MCF-7細胞5瓶，選取其中4瓶分別加入含培養(yǎng)液的苦參堿 4 ml，苦參堿濃度分別為 0.25、0.5、1.0、2.0 mg/ml為實驗組，取1瓶加入等量培養(yǎng)液為對照組。37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。藥物作用24 h和48 h后，將細胞0.25%胰酶消化，棄去消化液，加預(yù)冷的PBS洗滌，輕輕吹打貼壁細胞使之懸浮，收集細胞于尖底離心管內(nèi)離心(1 500 r/min 7 min)并調(diào)整細胞數(shù)為1×105個，相同方法PBS洗滌兩次，二次離心前先將細胞移入流式測定管內(nèi)離心，離心后24 h和48 h各實驗組和對照組均加入Bax單克隆抗體100μl，混勻后室溫下避光孵育30 min，上流式細胞儀(FACS)分析。

2 結(jié)果

2.1 苦參堿對MCF-7細胞生長的抑制率 苦參堿作用于乳腺癌MCF-7細胞24、48和72 h的生長抑制率分別為:6.61% ～35.58%、7.97% ～51.56%和11.98% ～68.31%。從表1看出，在24、48 h兩個實驗組中除了0.25 mg/ml及0.5 mg/ml這兩個低濃度組在組內(nèi)比較無顯著差異(P＞0.05)外，包括72 h在內(nèi)的實驗各組，組內(nèi)各濃度之間苦參堿對MCF-7細胞的抑制率比較，均存在顯著差異(P＜0.05)，苦參堿對MCF-7細胞的生長抑制率隨藥物濃度的增加而增高，呈劑量-效應(yīng)正相關(guān)，并且隨時間的延長其抑制率也相應(yīng)提高，呈時間-效應(yīng)正相關(guān)。見表1。

表1 苦參堿對MGF-7細胞的抑制率(±s，%)

表1 苦參堿對MGF-7細胞的抑制率(±s，%)

與前一濃度比較:1)P＜0.05;與上一時間點比較:2)P＜0.05

時間點0.25 mg/ml 0.5 mg/m l 1.0 mg/ml 2.0 mg/m l 24 h 6.61±0.50 7.67±0.64 19.50±2.12 35.58±1.38 48 h 7.97±0.41 9.61±0.67 32.56±1.602) 51.56±1.722)72 h 11.98±1.11 17.14±1.211)54.46±2.931)2)68.31±2.131)2)

2.2 苦參堿對乳腺癌MCF-7細胞凋亡的影響 苦參堿處理MCF-7細胞24 h后，用雙標法AnnexinV和PI對MCF-7細胞標記后經(jīng)流式細胞儀檢測，結(jié)果顯示:苦參堿對MCF-7細胞有明顯的凋亡促進作用，實驗組凋亡發(fā)生率對于4.17%～19.63%之間，與對照組 〔(1.10±0.08)%〕相比，均有顯著差異 (P＜0.05)。藥物各濃度組之間相比也存在顯著差異(P＜0.05)，并隨藥物濃度的提高，0.25、0.5、1.0、2.0 mg/ml苦參堿組凋亡的發(fā)生率也相應(yīng)增高，分別為(4.17±0.25)%、 (6.60±0.18)%、 (15.32±0.21)%和(19.63±0.17)%，且呈正相關(guān)。

2.3 線粒體膜電位的檢測結(jié)果 苦參堿處理MCF-7細胞24 h，羅丹明123經(jīng)流式細胞儀檢測，結(jié)果顯示，苦參堿處理MCF-7細胞羅丹明染色陽性數(shù)明顯低于對照組，與對照組〔(83.00±1.42)%〕相比有明顯差異 (P＜0.05)，并隨苦參堿作用濃度的增高而減少，為負相關(guān)。0.25、0.5、1.0、2.0 mg/ml苦參堿組線粒體膜電位分別為 (66.03±2.08)%、(61.28±1.29)%、 (60.55±0.87)%及 (56.30±1.87)%。0.5和1.0 mg/ml兩個濃度組相比較無明顯差異 (P＞0.05)外，各濃度組之間均有明顯差異 (P＜0.05)，因羅丹明染色陽性細胞數(shù)的變化反映了線粒體膜電位的變化，具有一致性。換言之，實驗組乳腺癌MCF-7細胞線粒體跨膜電位顯著低于對照組，隨作用藥物濃度的增加而下降程度加大，呈負相關(guān)。

2.4 苦參堿對MCF-7細胞Bax表達的影響 苦參堿作用于MCF-7細胞24 h、48 h后實驗組Bax蛋白陽性表達率分別介于0.80% ～11.93%和1.15% ～16.83%，均高于對照組，與對照組相比差異顯著(P＜0.05)，各濃度組間比較Bax蛋白陽性表達也存在顯著差異，且Bax蛋白表達隨藥物作用濃度增高表達增高，呈正相關(guān)。見表2。

表2 苦參堿對MCF-7細胞Bax表達的影響(±s，%)

表2 苦參堿對MCF-7細胞Bax表達的影響(±s，%)

與對照組比較:1)P＜0.05

時間點 對照組0.25 mg/m l 0.5 mg/ml 1.0 mg/ml 2.0 mg/m l 24 h 0.38±0.05 0.80±0.821)1.30±0.821)6.30±0.081)11.93±0.341)48 h 0.43±0.05 1.15±0.131)2.73±0.171)10.45±0.641)16.83±0.821)

3 討論

苦參堿作為多種中藥的有效成分之一，已被證明具有重要的生物學(xué)活性，如抗癌、抗病毒、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用，體外實驗表明苦參堿對多種腫瘤細胞有抑制或殺傷作用，對HEPG2、K562、HL260有明顯的抑制作用，并能誘導(dǎo)分化和凋亡〔4，5〕。Hua 等〔6〕的研究表明，苦參堿可誘導(dǎo)細胞色素 C釋放、激活caspase-3和caspase-9從而通過線粒體途徑誘導(dǎo)K562細胞凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)苦參堿對乳腺癌MCF-7細胞有明顯的生長抑制作用，隨苦參堿的作用濃度增高作用時間延長，對乳腺癌MCF-7細胞的生長抑制作用也增強。不同的凋亡指數(shù)(AI)，即凋亡細胞占細胞總數(shù)的百分比，在一定程度上與其對放、化療的敏感性、腫瘤分化程度、分級、發(fā)展及腫瘤的生物學(xué)行為有關(guān)。誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡是目前進行腫瘤控制與治療的可行方法之一，也是篩選抗癌藥物的指標之一。

本結(jié)果中MCF-7細胞凋亡率與王利民〔7〕報道的同濃度下苦參堿作用青肉瘤QS732細胞，檢測的凋亡率9.8%、16.9%相近，但高于馬玲娣等〔8〕報道的苦參堿作用與小鼠H22肝癌細胞檢測值4.32%和11.27%，這說明不同的腫瘤細胞對苦參堿的敏感性不同，可能觸發(fā)癌細胞凋亡機制也大不相同。

羅丹明123是一種可透過細胞膜的陽離子熒光染料，是一種線粒體跨膜電位的指示劑，其在正常細胞中能夠依賴線粒體跨膜電位進入線粒體基質(zhì)，熒光強度減弱或消失，而在凋亡發(fā)生時，線粒體膜完整性被破壞，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔開放，引起線粒體跨膜電位的崩解。Rh123從新釋放出線粒體，從而發(fā)出黃綠色熒光，可用流式細胞儀檢測。通過熒光信號的強弱來檢測線粒體膜電位的變化和凋亡的發(fā)生。研究表明線粒體膜電位的降低和去極化可停止合成ATP，使能量代謝受損，從而導(dǎo)致線粒體膜通透性開放，細胞發(fā)生凋亡〔9〕。本實驗結(jié)果推測苦參堿可能影響了線粒體跨膜電位MMP通道的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致MMP通道開放，觸發(fā)凋亡的發(fā)生，也可能改變了線粒體膜內(nèi)外兩側(cè)的某些離子使跨膜電位崩潰，MMP通道開放，位于內(nèi)外膜上的許多離子會逆流，均有可能觸發(fā)凋亡的產(chǎn)生。我們的實驗證實苦參堿能夠降低線粒體跨膜電位，誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細胞的凋亡，由哪種途徑引起有待進一步探討。

Bax家族是細胞內(nèi)重要的內(nèi)源性細胞凋亡抑制物成員之一，這些抑制物制約細胞凋亡機器的運行，維持細胞的正常生存，在細胞凋亡調(diào)控機制方面，Bax是迄今研究的最深入、廣泛的凋亡調(diào)控基因之一。Bax是一種細胞內(nèi)膜蛋白，主要定位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜。研究顯示Bax能夠通過下列途徑維持細胞正常，防止凋亡的發(fā)生。①如細胞氧化，還原狀態(tài)(如增加GSH，抑制ROS的產(chǎn)生與活化，增強過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的活性等)，漿膜的變化(抑制磷酸酯酰絲氨酸外翻)，細胞內(nèi)離子抑制(抑制Ca2+自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外流和向核外流，防止胞漿酸化)，抑制 caspase-3的活化等。②Bax與Bcl-2能夠抑制MMP開放和維持膜電位，進而阻止線粒體內(nèi)cyto C和AIF的釋放，也有人認為Bax與P53依賴的凋亡信號途徑重要中介物之一〔10，11〕。本實驗結(jié)果推測苦參堿可能通過某種途徑激活Bax基因并促進Bax蛋白合成，并從胞漿移至線粒體外膜，形成多聚體或高度有序的寡聚體，啟動MMP通道開放，使線粒體跨膜電位下降或崩潰，啟動凋亡程序，一起凋亡。另外，Bax的高表達也可能增強了某種凋亡信號，引發(fā)P53作用增強，從而誘導(dǎo)細胞凋亡，移至細胞增殖。

綜上，苦參堿通過多種環(huán)節(jié)，不同途徑和方式對腫瘤細胞有較強的抑制作用，促進腫瘤細胞凋亡，誘導(dǎo)分化，這種作用不是單一和獨立的，有可能是極為復(fù)雜，互相關(guān)聯(lián)，互相促進，甚至是多種因素綜合作用的結(jié)果。由此可見，苦參堿是極具前途的抗腫瘤中藥活性成分，尤其是對人乳腺癌細胞MCF-7細胞具有現(xiàn)實意義，因而具有廣闊的藥物研發(fā)和臨床應(yīng)用前景。

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R285

A

1005-9202(2012)16-3489-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.067

王淑強(1960-)，女，高級實驗師，主要從事腫瘤學(xué)研究。

〔2011-03-03收稿 2011-07-30修回〕

(編輯 曹夢園)