假酸漿水提液對2型糖尿病模型大鼠肝糖原合成關鍵酶表達的影響

卞德強 孟慶媛 龐玉軍 竇建華 王 昭 (佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 54007)

假酸漿水提液對2型糖尿病模型大鼠肝糖原合成關鍵酶表達的影響

卞德強 孟慶媛1龐玉軍 竇建華 王 昭1(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的 研究假酸漿(NPG)水提液對2型糖尿病(T2DM)模型大鼠肝糖原合成關鍵酶表達的影響。方法 用50只Wistar大鼠作為受試對象制作糖尿病模型。一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)制備2型糖尿病大鼠模型。以NPG水提液進行灌胃，測定血糖及肝臟糖原合成酶、葡萄糖-6-磷酸酶的表達水平。結果 NPG能有效地降低血糖。NPG水提液低劑量組(2.5 ml/kg)能增加大鼠肝臟組織糖原合成酶mRNA的表達(P＜0.05)，降低大鼠肝臟葡萄糖-6-磷酸酶mRNA的表達(P＜0.01)。結論 NPG是一種有效的降血糖藥，可以加強糖原合成，進而降低血糖。

假酸漿;糖原合成酶;葡萄糖-6-磷酸酶

假酸漿(NPG)為當年生茄科植物，其全草可以入藥，其花朵在民間常用于治療2型糖尿病(T2DM)，并有顯著的降糖效果〔1，2〕。本文主要研究NPG對T2DM模型大鼠的降糖作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 純系Wistar大鼠50只，雌雄各半，2～3月齡，體重200～250 g，由佳木斯大學動物實驗中心提供。

1.1.2 實驗中藥 中藥NPG由本課題組培養種植，經鑒定符合藥典標準。白糖、豬油、蛋黃粉由超市購得，均符合國家食品檢驗檢疫標準。

1.1.3 主要試劑 NPG水提液(佳木斯大學生物化學實驗室提制);二甲雙胍(湖北遠成藥業有限公司);瓊脂糖(華舜生物工程有限公司);焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水(上海生工生物工程有限公司);Trizol、RT-PCR試劑盒(大連寶生物有限公司);鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司)，引物由北京奧科生物有限公司合成。

1.1.4 實驗儀器 超凈工作臺(哈爾濱藍皓空氣凈化設備有限公司);DU800核酸蛋白分析儀(德國Beckman公司);TGL-20M高速臺式冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司);PCR儀(Whatman Biometra公司);YLN-2000凝膠成像分析系統(北京亞力恩機電技術研究所);強生血糖儀〔強生LIFESCAN，強生(上海)醫療器材有限公司〕。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備及分組給藥 隨機留取10只大鼠作為正常組(NOR)，給予基礎飼料，其余50只大鼠給予高糖高脂飼料。持續喂養4 w后，一次性腹腔注射STZ溶液50 mg/kg，而正常組注射相同體積的枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖液，72 h后測空腹血糖，以血糖值高于11.1 mmol/L為造模成功。NPG的花提純后的生藥濃度為0.2 g/ml。成模大鼠繼續喂以高糖高脂飼料，并隨機分為糖尿病模型組(MOD)、NPG高(JHG)、中(JHZ)、低(JHD)劑量治療組(10，5，2.5 m l·kg－1·d－1)，每組10只，連續灌胃8 w。模型組及正常組同時灌服生理鹽水。

1.2.2 標本采集 末次給藥后6 h，斷頭處死，取血清備用，取肝臟及骨骼肌置于液氮中速凍，迅速轉移置－80℃冰箱保存。

1.2.3 血糖、血脂檢測 采用強生血糖儀及全自動生化分析儀進行檢測。

1.2.4 總RNA抽提及鑒定 常溫解凍，切取約50 mg肝組織、小腸組織或50 mg骨骼肌組織分別置勻漿管中，勻漿管冰浴。往勻漿管中加入1 ml預冷的 Trizol液，勻漿，室溫放置5 min，4℃ 12 000 r/min離心5 min。轉移上清至一新Eppendorf(EP)管中，加入0.2 ml氯仿，蓋好管蓋，劇烈震蕩15 s，室溫放置5 min，4℃ 12 000 r/min離心15 min。轉移上層水相至另一新EP管中(約300～400μl)，加入0.5 ml異丙醇，充分混勻后室溫放置20 min，12 000 r/min離心10 min。棄上清，沉淀加入1 ml預冷的75%乙醇(DEPC水配制)振蕩洗滌RNA，沉淀一次，12 000 r/min離心5 min。小心棄去上清，沉淀置超凈工作臺開風機吹干，加 40μl DEPC水溶解。測定所提取總RNA的OD260/OD280，檢驗所提取的總RNA的純度，以OD260/OD280在1.8～2.0之間為純度較好，可以用于cDNA的合成。按RT-PCR試劑盒合成cDNA進行PCR反應。

1.2.5 PCR反應 以合成的cDNA為模板進行擴增反應。用β-actin作為內參。其引物分別為上游:TGCCCATCTATGAGGGTTAC;下游:CTGGAAGGTGGACAGTGAG，擴增片段長度為572 bp，退火溫度為59℃。糖原合成酶(GSY)引物分別為上游:CCATTCCCTGCCTGTTCCA;下游:ATCGGCTACCTTTGCTTTC，退火溫度為60℃，擴增片段長度為698 bp。葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)引物分別為上游:CACCTTGACACTACACCCTT;下游:AATCCACCAAACACTCCC，退火溫度為59℃，擴增片段長度為697 bp。

1.2.6 PCR擴增產物電泳 PCR產物與上樣緩沖液按4∶1混合，每孔道加8μl混合液，上樣后于電泳槽中電泳，電壓為80 V，時間為40 min，EB中染色15 min，結果用凝膠成像系統掃描，用目的基因區帶的灰度值與內參β-actin區帶的灰度值之比確定各目的基因的表達水平。

1.3 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件進行分析，實驗結果以±s表示，進行方差分析，組間差異性檢驗用q檢驗。

2 結果

2．1各組大鼠血糖、血脂水平變化 STZ注射72 h后大鼠血糖、血脂變化見表1。用藥8 w末大鼠血糖變化見表2。

2．2各組大鼠GSY mRNA水平比較 糖尿病模型組大鼠GSY mRNA表達水平(0.481±0.159)比正常組(0.967±0.272)明顯減少，NPG低劑量組大鼠肝臟GSY mRNA表達水平(0.910±0.248)較模型組上調，差異有極顯著性意義(P＜0.01)。NPG中、高劑量組GSYmRNA表達水平分別為0.543±0.195、0.669±0.222。提示NPG低劑量可提高糖尿病大鼠肝臟GSY mRNA的表達。見圖1。

2．3各組大鼠G6PmRNA表達水平比較 糖尿病模型組大鼠G6PmRNA表達水平(0.901±0.253)比正常組(0.570±0.183)明顯增多，NPG低劑量組大鼠肝臟G6PmRNA表達水平(0.556±0.175)較模型組下調，差異有極顯著性意義。提示NPG低劑量可降低糖尿病大鼠肝臟G6PmRNA的表達。NPG中、高劑量組 G6P mRNA表達水平分別為 0.670±0.182、0.752±0.225。見圖2。

表1 各組大鼠血脂、血糖變化(±s，mmol/L)

表1 各組大鼠血脂、血糖變化(±s，mmol/L)

與正常組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;下表同

組別 n 血糖 血脂正常組10 5.0±0.65 0.32±0.18造模組 40 21.6±4.91) 0.55±0.212)

表2 各組大鼠用藥前后空腹血糖變化(±s，n=10，mmol/L)

表2 各組大鼠用藥前后空腹血糖變化(±s，n=10，mmol/L)

組別 給藥前血糖 給藥第8周末血糖正常組 5.0±0.62) 5.0±1.42)模型組 22.6±4.9 30.6±7.9 NPG低劑量組 23.2±4.0 12.7±4.12)NPG中劑量組 21.5±3.4 18.4±3.72)NPG高劑量組 21.7±4.6 22.3±1.41)

圖1 各組GSY m RNA表達水平

圖2 各組G6Pm RNA表達水平

3 討論

糖尿病的主要表現為病理性高血糖。因此，糖尿病的治療中最關鍵的環節還是降血糖。高血糖發生的本質是血糖的生成與消耗之間失去了正常的動態平衡。糖原合成減少，分解加速，在酶的作用下，大量G6P轉化為葡萄糖;糖原異生作用加強，即由非糖物質轉化為葡萄糖的速度加快，葡萄糖生成增多，葡萄糖轉化為G6P的作用減弱，葡萄糖的利用減慢;糖酵解和三梭酸循環減弱;在肌肉及脂肪組織中，葡萄糖進入細胞膜的速度減慢。所有這些作用的結果將導致葡萄糖的生成增多，消耗減少，從而造成高血糖。而GSY是肝臟和肌肉糖原合成的限速酶，是胰島素作用的主要靶酶，其去磷酸化后即被激活，磷酸化時即失去活性〔3〕。胰島素能夠抑制內源性葡萄糖的產生和刺激外周組織攝取葡萄糖，增加肝臟合成糖原的能力，通過激活GSY磷酸酶，使GSY去磷酸化，從而提高GSY的活性，促進糖原合成。糖原合成受損，就會出現血糖升高。

G6P是催化G6P水解為葡萄糖的關鍵酶，該反應是糖原分解和糖異生的最后一步反應〔4〕。肝臟G6P的合成與水解失平衡是導致糖尿病肝糖輸出調節功能異常的主要原因。通過實驗發現，NPG水提液可明顯減低糖尿病模型大鼠血糖，NPG水提液低劑量組能增加大鼠肝臟組織糖原合成酶mRNA的表達，降低大鼠肝臟G6PmRNA的表達，從而抑制糖異生，促進糖原合成，降低血糖。

本實驗表明，NPG可以降低T2DM模型大鼠血糖，上調大鼠肝臟GSY mRNA的表達，下調大鼠肝臟G6PmRNA的表達，從而降低T2DM模型大鼠的血糖。

1 Oda K.Examination of the treatmentof eldly type2 diabetes is it possible to change from insulin to oral hypoglycemic agents〔J〕.Gan To Kagaku Ryoho，2000;27(3):711-3.

2 周衛芬，王秋娟，韓 瑩，等.香豆素磺酰脲類化合物的降血糖作用研究〔J〕.中國藥科大學學報，2003;34(2):160-2.

3 Grimes CA，Jope RS.Themultifaceted roles of glycogen synthase kinase 3beta in cellular signaling〔J〕.Prog Neurobiol，2001;65(4):391-426.

4 劉德敏，方顯峰，孫 穎，等.氯化鋰對大鼠肝細胞葡萄糖-6-磷酸酶基因表達的影響〔J〕.天津醫科大學學報，2006;12(1):14-6.

R587.1

A

1005-9202(2012)16-3492-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.068

1 佳木斯大學基礎醫學院

王 昭(1972-)，男，副教授，博士，主要從事腫瘤與糖尿病藥物的研究。

卞德強(1978-)，男，醫師，碩士，主要從事糖尿病的治療與藥品開發研究。

〔2012-02-15收稿 2012-03-04修回〕

(編輯 袁左鳴)