假酸漿水提液對2型糖尿病模型大鼠肝糖原合成關(guān)鍵酶表達(dá)的影響

卞德強(qiáng) 孟慶媛 龐玉軍 竇建華 王 昭 (佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 54007)

假酸漿水提液對2型糖尿病模型大鼠肝糖原合成關(guān)鍵酶表達(dá)的影響

卞德強(qiáng) 孟慶媛1龐玉軍 竇建華 王 昭1(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的 研究假酸漿(NPG)水提液對2型糖尿病(T2DM)模型大鼠肝糖原合成關(guān)鍵酶表達(dá)的影響。方法 用50只Wistar大鼠作為受試對象制作糖尿病模型。一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)制備2型糖尿病大鼠模型。以NPG水提液進(jìn)行灌胃，測定血糖及肝臟糖原合成酶、葡萄糖-6-磷酸酶的表達(dá)水平。結(jié)果 NPG能有效地降低血糖。NPG水提液低劑量組(2.5 ml/kg)能增加大鼠肝臟組織糖原合成酶mRNA的表達(dá)(P＜0.05)，降低大鼠肝臟葡萄糖-6-磷酸酶mRNA的表達(dá)(P＜0.01)。結(jié)論 NPG是一種有效的降血糖藥，可以加強(qiáng)糖原合成，進(jìn)而降低血糖。

假酸漿;糖原合成酶;葡萄糖-6-磷酸酶

假酸漿(NPG)為當(dāng)年生茄科植物，其全草可以入藥，其花朵在民間常用于治療2型糖尿病(T2DM)，并有顯著的降糖效果〔1，2〕。本文主要研究NPG對T2DM模型大鼠的降糖作用及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 純系Wistar大鼠50只，雌雄各半，2～3月齡，體重200～250 g，由佳木斯大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)中藥 中藥NPG由本課題組培養(yǎng)種植，經(jīng)鑒定符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。白糖、豬油、蛋黃粉由超市購得，均符合國家食品檢驗(yàn)檢疫標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.3 主要試劑 NPG水提液(佳木斯大學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提制);二甲雙胍(湖北遠(yuǎn)成藥業(yè)有限公司);瓊脂糖(華舜生物工程有限公司);焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水(上海生工生物工程有限公司);Trizol、RT-PCR試劑盒(大連寶生物有限公司);鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司)，引物由北京奧科生物有限公司合成。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 超凈工作臺(哈爾濱藍(lán)皓空氣凈化設(shè)備有限公司);DU800核酸蛋白分析儀(德國Beckman公司);TGL-20M高速臺式冷凍離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司);PCR儀(Whatman Biometra公司);YLN-2000凝膠成像分析系統(tǒng)(北京亞力恩機(jī)電技術(shù)研究所);強(qiáng)生血糖儀〔強(qiáng)生LIFESCAN，強(qiáng)生(上海)醫(yī)療器材有限公司〕。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備及分組給藥 隨機(jī)留取10只大鼠作為正常組(NOR)，給予基礎(chǔ)飼料，其余50只大鼠給予高糖高脂飼料。持續(xù)喂養(yǎng)4 w后，一次性腹腔注射STZ溶液50 mg/kg，而正常組注射相同體積的枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖液，72 h后測空腹血糖，以血糖值高于11.1 mmol/L為造模成功。NPG的花提純后的生藥濃度為0.2 g/ml。成模大鼠繼續(xù)喂以高糖高脂飼料，并隨機(jī)分為糖尿病模型組(MOD)、NPG高(JHG)、中(JHZ)、低(JHD)劑量治療組(10，5，2.5 m l·kg－1·d－1)，每組10只，連續(xù)灌胃8 w。模型組及正常組同時灌服生理鹽水。

1.2.2 標(biāo)本采集 末次給藥后6 h，斷頭處死，取血清備用，取肝臟及骨骼肌置于液氮中速凍，迅速轉(zhuǎn)移置－80℃冰箱保存。

1.2.3 血糖、血脂檢測 采用強(qiáng)生血糖儀及全自動生化分析儀進(jìn)行檢測。

1.2.4 總RNA抽提及鑒定 常溫解凍，切取約50 mg肝組織、小腸組織或50 mg骨骼肌組織分別置勻漿管中，勻漿管冰浴。往勻漿管中加入1 ml預(yù)冷的 Trizol液，勻漿，室溫放置5 min，4℃ 12 000 r/min離心5 min。轉(zhuǎn)移上清至一新Eppendorf(EP)管中，加入0.2 ml氯仿，蓋好管蓋，劇烈震蕩15 s，室溫放置5 min，4℃ 12 000 r/min離心15 min。轉(zhuǎn)移上層水相至另一新EP管中(約300～400μl)，加入0.5 ml異丙醇，充分混勻后室溫放置20 min，12 000 r/min離心10 min。棄上清，沉淀加入1 ml預(yù)冷的75%乙醇(DEPC水配制)振蕩洗滌RNA，沉淀一次，12 000 r/min離心5 min。小心棄去上清，沉淀置超凈工作臺開風(fēng)機(jī)吹干，加 40μl DEPC水溶解。測定所提取總RNA的OD260/OD280，檢驗(yàn)所提取的總RNA的純度，以O(shè)D260/OD280在1.8～2.0之間為純度較好，可以用于cDNA的合成。按RT-PCR試劑盒合成cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.2.5 PCR反應(yīng) 以合成的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。用β-actin作為內(nèi)參。其引物分別為上游:TGCCCATCTATGAGGGTTAC;下游:CTGGAAGGTGGACAGTGAG，擴(kuò)增片段長度為572 bp，退火溫度為59℃。糖原合成酶(GSY)引物分別為上游:CCATTCCCTGCCTGTTCCA;下游:ATCGGCTACCTTTGCTTTC，退火溫度為60℃，擴(kuò)增片段長度為698 bp。葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)引物分別為上游:CACCTTGACACTACACCCTT;下游:AATCCACCAAACACTCCC，退火溫度為59℃，擴(kuò)增片段長度為697 bp。

1.2.6 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳 PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液按4∶1混合，每孔道加8μl混合液，上樣后于電泳槽中電泳，電壓為80 V，時間為40 min，EB中染色15 min，結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)掃描，用目的基因區(qū)帶的灰度值與內(nèi)參β-actin區(qū)帶的灰度值之比確定各目的基因的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，進(jìn)行方差分析，組間差異性檢驗(yàn)用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2．1各組大鼠血糖、血脂水平變化 STZ注射72 h后大鼠血糖、血脂變化見表1。用藥8 w末大鼠血糖變化見表2。

2．2各組大鼠GSY mRNA水平比較 糖尿病模型組大鼠GSY mRNA表達(dá)水平(0.481±0.159)比正常組(0.967±0.272)明顯減少，NPG低劑量組大鼠肝臟GSY mRNA表達(dá)水平(0.910±0.248)較模型組上調(diào)，差異有極顯著性意義(P＜0.01)。NPG中、高劑量組GSYmRNA表達(dá)水平分別為0.543±0.195、0.669±0.222。提示NPG低劑量可提高糖尿病大鼠肝臟GSY mRNA的表達(dá)。見圖1。

2．3各組大鼠G6PmRNA表達(dá)水平比較 糖尿病模型組大鼠G6PmRNA表達(dá)水平(0.901±0.253)比正常組(0.570±0.183)明顯增多，NPG低劑量組大鼠肝臟G6PmRNA表達(dá)水平(0.556±0.175)較模型組下調(diào)，差異有極顯著性意義。提示NPG低劑量可降低糖尿病大鼠肝臟G6PmRNA的表達(dá)。NPG中、高劑量組 G6P mRNA表達(dá)水平分別為 0.670±0.182、0.752±0.225。見圖2。

表1 各組大鼠血脂、血糖變化(±s，mmol/L)

表1 各組大鼠血脂、血糖變化(±s，mmol/L)

與正常組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;下表同

組別 n 血糖 血脂正常組10 5.0±0.65 0.32±0.18造模組 40 21.6±4.91) 0.55±0.212)

表2 各組大鼠用藥前后空腹血糖變化(±s，n=10，mmol/L)

表2 各組大鼠用藥前后空腹血糖變化(±s，n=10，mmol/L)

組別 給藥前血糖 給藥第8周末血糖正常組 5.0±0.62) 5.0±1.42)模型組 22.6±4.9 30.6±7.9 NPG低劑量組 23.2±4.0 12.7±4.12)NPG中劑量組 21.5±3.4 18.4±3.72)NPG高劑量組 21.7±4.6 22.3±1.41)

圖1 各組GSY m RNA表達(dá)水平

圖2 各組G6Pm RNA表達(dá)水平

3 討論

糖尿病的主要表現(xiàn)為病理性高血糖。因此，糖尿病的治療中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)還是降血糖。高血糖發(fā)生的本質(zhì)是血糖的生成與消耗之間失去了正常的動態(tài)平衡。糖原合成減少，分解加速，在酶的作用下，大量G6P轉(zhuǎn)化為葡萄糖;糖原異生作用加強(qiáng)，即由非糖物質(zhì)轉(zhuǎn)化為葡萄糖的速度加快，葡萄糖生成增多，葡萄糖轉(zhuǎn)化為G6P的作用減弱，葡萄糖的利用減慢;糖酵解和三梭酸循環(huán)減弱;在肌肉及脂肪組織中，葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞膜的速度減慢。所有這些作用的結(jié)果將導(dǎo)致葡萄糖的生成增多，消耗減少，從而造成高血糖。而GSY是肝臟和肌肉糖原合成的限速酶，是胰島素作用的主要靶酶，其去磷酸化后即被激活，磷酸化時即失去活性〔3〕。胰島素能夠抑制內(nèi)源性葡萄糖的產(chǎn)生和刺激外周組織攝取葡萄糖，增加肝臟合成糖原的能力，通過激活GSY磷酸酶，使GSY去磷酸化，從而提高GSY的活性，促進(jìn)糖原合成。糖原合成受損，就會出現(xiàn)血糖升高。

G6P是催化G6P水解為葡萄糖的關(guān)鍵酶，該反應(yīng)是糖原分解和糖異生的最后一步反應(yīng)〔4〕。肝臟G6P的合成與水解失平衡是導(dǎo)致糖尿病肝糖輸出調(diào)節(jié)功能異常的主要原因。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NPG水提液可明顯減低糖尿病模型大鼠血糖，NPG水提液低劑量組能增加大鼠肝臟組織糖原合成酶mRNA的表達(dá)，降低大鼠肝臟G6PmRNA的表達(dá)，從而抑制糖異生，促進(jìn)糖原合成，降低血糖。

本實(shí)驗(yàn)表明，NPG可以降低T2DM模型大鼠血糖，上調(diào)大鼠肝臟GSY mRNA的表達(dá)，下調(diào)大鼠肝臟G6PmRNA的表達(dá)，從而降低T2DM模型大鼠的血糖。

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2 周衛(wèi)芬，王秋娟，韓 瑩，等.香豆素磺酰脲類化合物的降血糖作用研究〔J〕.中國藥科大學(xué)學(xué)報，2003;34(2):160-2.

3 Grimes CA，Jope RS.Themultifaceted roles of glycogen synthase kinase 3beta in cellular signaling〔J〕.Prog Neurobiol，2001;65(4):391-426.

4 劉德敏，方顯峰，孫 穎，等.氯化鋰對大鼠肝細(xì)胞葡萄糖-6-磷酸酶基因表達(dá)的影響〔J〕.天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2006;12(1):14-6.

R587.1

A

1005-9202(2012)16-3492-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.068

1 佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

王 昭(1972-)，男，副教授，博士，主要從事腫瘤與糖尿病藥物的研究。

卞德強(qiáng)(1978-)，男，醫(yī)師，碩士，主要從事糖尿病的治療與藥品開發(fā)研究。

〔2012-02-15收稿 2012-03-04修回〕

(編輯 袁左鳴)