應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)老年動(dòng)脈粥樣硬化患者血清抗負(fù)電性低密度脂蛋白自身抗體含量

程金華 (齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)老年動(dòng)脈粥樣硬化患者血清抗負(fù)電性低密度脂蛋白自身抗體含量

程金華 (齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的 建立一種通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)定量測(cè)定動(dòng)脈粥樣硬化患者血清中抗負(fù)電性低密度脂蛋白〔LDL(－)〕自身抗體含量的方法。方法 從老年動(dòng)脈粥樣硬化患者血清中純化得到LDL(－)，吸附到96孔板用于特異性捕獲抗LDL(－)自身抗體。對(duì)酶聯(lián)免疫吸附的最低檢測(cè)限(LOD)、定量限(LOQ)、批內(nèi)和批間的精密度以及準(zhǔn)確度、回收率進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果 抗LDL(－)-ELISA分析法線性回歸方程為y=1.250 4x+3.292 6(R2=0.994)，線性范圍在為0.004～0.125 mU/L。批內(nèi)和批間的精密度和準(zhǔn)確度、回收率均符合免疫分析要求。結(jié)論 本文建立的ELISA方法可用于老年動(dòng)脈粥樣硬化患者血清內(nèi)抗LDL(－)自身抗體的定量分析、臨床研究和生化調(diào)查。

抗負(fù)電性LDL(－)自身抗體;ELISA;評(píng)價(jià);動(dòng)脈粥樣硬化

多種抗原刺激物與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病相關(guān)，這些刺激大多來(lái)自修飾后的自身抗原負(fù)電性低密度脂蛋白〔LDL(－)〕是存在于血清中的修飾度較小的一類LDL，具有致炎和致動(dòng)脈粥樣硬化作用。LDL(－)具有免疫原性，并且人血清中存在針對(duì)LDL(－)表位的自身抗體〔1〕。LDL(－)通過炎癥和免疫機(jī)制，使機(jī)體生產(chǎn)的抗LDL(－)自身抗體導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生〔2〕。本文擬建立一種通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)定量測(cè)定老年動(dòng)脈粥樣硬化患者血清中游離抗LDL(－)自身抗體含量的方法。

1 材料與方法

1.1 分離LDL(－) 按照參考文獻(xiàn)〔3〕方法分離從35名60～80歲老年動(dòng)脈粥樣硬化患者體內(nèi)獲得的血清樣本，得到純化的LDL(－)，通過5%瓊脂糖電泳檢測(cè)，上樣使用10μg LDL(－)和天然LDL，60 V穩(wěn)壓電泳2 h，用0.5%考馬斯亮藍(lán)G快速測(cè)定試劑盒顯色比較。

1.2 ELISA分析方法建立

1.2.1 方法步驟 在50μl 0.05 mol/L碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中溶解LDL(－)配制成1μg/ml溶液，均勻涂布在96孔板(COSTAR，紐約，康寧)底部，4℃保存過夜。然后用含0.05%吐溫 20的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)洗滌 3次(200μl/孔)。用含2%脫脂奶粉(預(yù)先加熱到100℃)和0.01%的吐溫20的PBS緩沖溶液封閉(150μl/孔)，37℃孵育90min。用上述的緩沖溶液再洗滌3次(200μl/孔)。將標(biāo)準(zhǔn)或樣本血清用含有1%脫脂奶粉和0.01%吐溫20的PBS按照1∶400稀釋，加入到96孔板中(50μl/孔)，37℃孵育90 min。用抗人-IgG結(jié)合辣根過氧化物酶(Bio-Rad公司，按1∶2 500稀釋)的抗體37℃孵育1 h。過氧化物酶的活性用50μl TMB(Sigma公司)檢測(cè)，37℃孵育10 min。加入0.5 mol/L的硫酸停止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀(北京普朗公司)測(cè)量450 nm處吸光值(A450)。

1.2.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別用6個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)單克隆抗體(0.001，0.008，0.016，0.031，0.063，0.125 mU/L)作為標(biāo)準(zhǔn)液，一式三份，用1.2.1的方法檢測(cè)A450值，繪制工作標(biāo)準(zhǔn)曲線，帶入下列公式:y=a×x+b，其中y是在450 nm處的吸光度，x為log10 LDL(－)濃度，a和b分別為校準(zhǔn)斜率和截距。

1.2.3 最低檢測(cè)限和最低定量限(LOD，LOQ) 將標(biāo)準(zhǔn)樣品三倍稀釋直到抗體濃度為0.000 2 mU/L，用1.2.1的方法測(cè)A450值，用10個(gè)樣品的平均吸光值和3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差表示LOD:LOD=M10B+3SDB，用10個(gè)樣品的平均吸光值和10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差表示LOQ:LOQ=M10B+10SDB。

1.2.4 精密度和準(zhǔn)確度 將含抗LDL(－)自身抗體的血清樣品稀釋成3不同濃度，使其濃度在整個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)(最低定量限附近1個(gè)，中心附近1個(gè)，標(biāo)準(zhǔn)曲線上邊界附近1個(gè))。批內(nèi)精密度通過對(duì)每個(gè)濃度樣品重復(fù)測(cè)定10次進(jìn)行比較。批間精密度通過對(duì)上述濃度樣品分5 d各重復(fù)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果用變異系數(shù)(CV%)表示。LOQ附近濃度樣品的批內(nèi)和批間精密度CV%應(yīng)小于20%，其他濃度應(yīng)小于15%。準(zhǔn)確度通過測(cè)定含內(nèi)標(biāo)的抗LDL(－)自身抗體的回收率(R%)表示。回收率應(yīng)在額定濃度80%～120%范圍內(nèi)。

1.2.5 干擾物質(zhì) 將血清樣品分別加入含有不同濃度的潛在干擾劑，如脂類(甘油三酯等)、總膽紅素和血紅蛋白。分別測(cè)定加入上述干擾劑前后的A450值，前后數(shù)值大于20%變化的視為干擾物質(zhì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

得到的純化物用瓊脂糖電泳分析結(jié)果，LDL(－)遷移率較天然LDL大。抗LDL(－)自身抗體濃度線性回歸方程為y=1.250 4x+3.292 6(R2=0.994)，線性范圍為 0.004～0.125 mU/L。血清按1∶100，1∶200，1∶400 和 1∶800 稀釋均得到較好的線性。見圖 1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，LOD、LOQ分別為0.002 8 mU/L和0.003 2 mU/L，準(zhǔn)確度用回收率法表示，回收率為96.7%到112.9%。低濃度(0.006 mU/L)批內(nèi)、批間、可接受CV分別為6.3%、17.1%、20.0%，中濃度(0.061 mU/L)分別為8.4%、10.1%、15.0%，高濃度(0.110 mU/L)分別為7.2%、11.3%、15.0%。抗LDL(－)自身抗體加入量為0.008、0.012、0.024、0.030 nU/L 時(shí)回收率(R%)分別為 98.5 ±6.5，96.7±2.2，112.9±1.2，104.3±2.1。干擾物質(zhì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抗LDL(－)自身抗體的ELISA分析沒有顯著干擾物質(zhì)，添加的脂類物質(zhì)高達(dá)800 mg/dl(以甘油三酯計(jì))、總膽紅素高達(dá)20 mg/dl和血紅蛋白高達(dá)250 mg/dl，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生的變化量分別是8.6%、1.2%和11.2%，小于規(guī)定的20%。

圖1 抗LDL(－)自身抗體ELISA法標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 討論

免疫分析檢測(cè)法在對(duì)疾病常規(guī)診斷和監(jiān)測(cè)上發(fā)揮重要作用，本研究的目的是發(fā)展一種快速、高效、準(zhǔn)確的ELISA法分析老年動(dòng)脈粥樣硬化患者血清中的抗LDL(－)自身抗體的濃度。本法利用老年動(dòng)脈粥樣硬化患者體內(nèi)提取的血清中分離出而非體外修飾的LDL(－)作為抗原，因此純化抗原是關(guān)鍵的一步。如果抗原在凈化過程中存在污染物，在后面的酶聯(lián)免疫吸附過程中可能會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)，這可能喪失特異性。本文中抗LDL(－)-ELISA法使用通過色譜純化的LDL(－)，從而保證了檢測(cè)質(zhì)量。體外修飾的LDL與體內(nèi)修飾的LDL的表位抗原有多大程度相同尚不清楚。本研究的最大優(yōu)點(diǎn)是開發(fā)了一種特異性檢測(cè)針對(duì)內(nèi)源性修飾抗LDL(－)自身抗體的酶聯(lián)免疫吸附分析法。經(jīng)過方法驗(yàn)證，該方法批內(nèi)和批間的精密度和回收率符合免疫分析的要求〔5〕，樣品血清中存在的血脂、總膽紅素和血紅蛋白對(duì)檢測(cè)沒有嚴(yán)重影響。另外將血清儲(chǔ)存在－20℃ ～80℃長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著影響，但應(yīng)減少樣本的反復(fù)凍融。

1 Pedrosa AM，F(xiàn)aine LA，Grosso DM，et al.Electronegative LDL induction of apoptosis in macrophages:involvement of Nrf2〔J〕.Biochim Biophys Acta，2010;1801(4):430-7.

2 Siqueira AA，Osiro K，Hirai AT，etal.Antibodies against charged subfractions of LDLs are associated with disturbed ankle-brachial index and cardiovascular risk factors in a Japanese-Brazili an population with high prevalence of dislipidemias〔J〕.Int JAtheroscler，2007;2(1):68-74.

3 Santo-Faulin-Tdo E，Sena KC，Rodrigues-Telles AE，et al.Validation of a novel ELISA formeasurement of electronegative LDL〔J〕.Clin Chem Lab Med，2008;46(12):1769-75.

4 Findlay JW，Smith WC，Lee JW，et al.Validation of immunoassays for bioanalysis:a pharmaceutical industry perspective〔J〕.JPharm Biomed Anal，2000;21(6):1249-73.

R587

A

1005-9202(2012)16-3444-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.042

程金華(1969-)，女，主管技師，主要從事醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)免疫研究。

〔2012-05-17收稿 2012-06-10修回〕

(編輯 袁左鳴)