銀杏總黃酮對糖尿病大鼠心肌轉化生長因子-β1表達的影響

張 翠 張根葆 朱海龍 (皖南醫學院病理生理教研室，安徽 蕪湖 241002)

銀杏總黃酮對糖尿病大鼠心肌轉化生長因子-β1表達的影響

張 翠 張根葆 朱海龍 (皖南醫學院病理生理教研室，安徽 蕪湖 241002)

目的探討銀杏總黃酮對糖尿病大鼠的抗氧化作用及對心肌轉化生長因子(TGF)-β1表達的影響。方法SD大鼠隨機分為:正常對照組、糖尿病模型組、銀杏總黃酮組，采用腹腔注射鏈脲佐菌素(STE)法建立糖尿病大鼠模型，生化方法檢測血糖，血及心肌組織超氧化物歧化酶(SOD)的活性及丙二醛(MDA)的含量;ELISA法檢測各組心肌TGF-β1水平;光鏡觀察心肌組織形態改變。結果與糖尿病模型組相比，銀杏總黃酮組大鼠血糖水平明顯降低，血清及心肌組織SOD活性升高，MDA含量顯著降低，心肌組織TGF-β1蛋白水平與糖尿病模型組相比明顯下降。結論銀杏總黃酮能夠減輕STZ誘導的糖尿病大鼠心肌氧化應激程度，降低心肌TGF-β1蛋白表達水平，對糖尿病心肌具有一定的保護作用。

銀杏總黃酮;糖尿病心肌病;轉化生長因子β1;氧化應激

研究證實，氧化應激啟動并參與糖尿病心肌病(DCM)發生發展的各個環節〔1〕。銀杏提取物主要有效成分為黃酮類和銀杏內酯類生物活性物質，具有廣泛的藥用價值，其對心腦血管及多種疾病有確切治療作用〔2〕。黃酮類化合物具有抗氧化、抑制α2葡萄糖苷酶、抗炎、抑制醛糖還原酶等作用，對糖尿病及其并發癥具有一定的預防和治療作用〔3〕，但銀杏總黃酮對糖尿病心臟是否具有保護作用，文獻報道較少。本實驗探討銀杏總黃酮對DCM的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雌性SD大鼠28只，體重180～220 g，由南京青龍山動物養殖場提供。銀杏葉總黃酮購自南京青澤醫藥有限公司;STZ購自Sigma公司;血糖檢測試劑盒購自長春迪瑞實業有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、考馬斯亮藍檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，轉化生長因子(TGF)-β1檢測試劑盒(ELISA)購自美國RD公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立與分組 大鼠隨機分為3組:正常對照組(8只):生理鹽水2 m l/d灌胃;糖尿病模型組(10只):生理鹽水2 ml/d灌胃;銀杏總黃酮組(10只):銀杏總黃酮250 mg·kg－1·d－1灌胃。糖尿病模型組和銀杏總黃酮組大鼠禁食12 h后腹腔注射溶于無菌枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液(pH4.5)的STZ，用量為65 mg/kg，正常對照組注射等體積的無菌枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液，48 h后空腹尾靜脈采血測血糖，血糖值≥13.8 mmol/L的大鼠視為糖尿病模型復制成功。

1.2.2 標本收集 模型復制成功30 d后處死各組大鼠，3%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠，頸動脈插管取血，4℃離心分離血清置－20℃保存。打開胸腔后，迅速整體取出心臟并放入冰生理鹽水中漂洗，取心尖部組織置－80℃保存，用于檢測心肌組織SOD活性、MDA含量及TGF-β1蛋白水平，余下部分于4%的中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，供形態學檢測。

1.2.3 生化指標的檢測 取少許心尖部組織在冰冷的生理鹽水中漂洗，濾紙拭干，剪碎，放入勻漿器內，以預冷的生理鹽水為勻漿介質，在冰上研磨制成10%組織勻漿，用低溫低速離心機4 000 r/min，離心10 min，取上清液測定。應用羥胺法測血及心肌勻漿SOD活性，硫代巴比妥酸(TBA)法測定MDA含量，均嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.4 ELISA法檢測血清及心肌TGF-β1水平 采用ELISA法測大鼠血和心肌TGF-β1水平，嚴格按試劑盒說明書檢測。

1.2.5 形態學檢測 心肌組織行石蠟切片，HE染色，光鏡觀察心肌組織形態學改變。

1.3 統計學處理 用SPSS12.0統計軟件處理，數據用±s表示，兩組間差異顯著性比較用t檢驗。

2 結果

2.1 大鼠的一般狀況 糖尿病模型組大鼠逐漸出現多飲、多食、多尿等典型的糖尿病表現，正常對照組飲水、進食量、尿量基本正常，精神狀態良好，體重明顯增加，銀杏總黃酮治療組大鼠多飲、多食、多尿現象均有一定改善。

2.2 銀杏總黃酮對STZ誘導的糖尿病大鼠體重及血糖的影響由表1可知，與正常對照組相比，糖尿病模型組大鼠血糖明顯升高，經銀杏總黃酮治療后，大鼠血糖水平與模型組相比顯著降低;模型組大鼠體重與對照組相比顯著下降，而銀杏總黃酮治療組體重有所增加。

2.3 銀杏總黃酮對大鼠血清SOD活性、MDA含量的影響 糖尿病模型組大鼠血清SOD活性與正常對照組比較明顯降低，MDA含量顯著升高，而銀杏總黃酮治療組大鼠的SOD活性較糖尿病模型組有顯著提高，與此相應，MDA含量明顯下降。見表2。

2.4 銀杏總黃酮對大鼠心肌組織SOD活性、MDA含量的影響從表2看出，糖尿病模型組大鼠心肌組織SOD活性與正常對照組比較明顯降低，而MDA含量顯著升高;銀杏葉總黃酮治療組大鼠心肌SOD活性較糖尿病模型組有顯著提高;同時，MDA含量明顯下降。

2.5 銀杏總黃酮對大鼠血清及心肌組織TGF-β1表達的影響與正常對照組比較，糖尿病模型組大鼠血清及心肌組織

TGF-β1表達水平顯著增高;而銀杏總黃酮治療組大鼠血清及心肌組織TGF-β1表達水平明顯下降。見表2。

表1 銀杏總黃酮對各組大鼠體重及血糖的影響(±s)

表1 銀杏總黃酮對各組大鼠體重及血糖的影響(±s)

與正常對照組比較:1)P＜0.01;與糖尿病模型組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01

組別 n 體重(g)治療前 治療后 血糖(mmol/L)8 205.75±11.34 303.75 ±20.48 5.75±1.02糖尿病模型組 10 209.60±12.29 165.90±12.321)25.33±5.071)銀杏總黃酮組 10 204.10 ±10.18 225.40±16.983)20.64±4.182)正常對照組

表2 銀杏葉總黃酮對大鼠血清、心肌SOD活性、MDA含量、TGF-β1表達的影響(±s)

表2 銀杏葉總黃酮對大鼠血清、心肌SOD活性、MDA含量、TGF-β1表達的影響(±s)

與正常對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與糖尿病模型組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01

組別 n 血清SOD(U/ml) MDA(nmol/ml)心肌SOD(U/ml) MDA(nmol/ml)TGF-β1血清(ng/L) 心肌(ng/L)0.30 12.70±2.21 50.18±12.40糖尿病模型組 10 99.47±16.181) 7.83±1.141) 218.06±43.911) 2.89±0.532) 21.86±4.251) 118.26±26.191)銀杏總黃酮組 10 117.86±17.413) 6.52±1.193) 261.87±41.293) 2.42±0.413) 17.56±3.683) 90.17±15.994)正常對照組 8 138.48±22.14 4.78±0.77 283.12±68.93 1.59±

2.6 銀杏總黃酮對大鼠心肌組織形態學的影響 正常對照組心肌細胞排列整齊，著色均勻，糖尿病模型組大鼠心肌細胞排列紊亂，扭曲，心肌細胞肥大，空泡變性，并見局灶性心肌纖維溶解壞死，結構不清，銀杏總黃酮治療組病變與模型組相比明顯減輕。見圖1。

圖1 各組心肌組織病理比較(HE，×400)

3 討論

高血糖是DCM發生的關鍵環節，糖尿病血糖增高后能夠啟動多種有害因素，進而引起心肌纖維化和膠原沉積。多種黃酮類藥物能降低糖尿病患者血糖水平〔4〕，本結果提示其在一定程度上能夠改善糖尿病大鼠血糖水平，與以往報道相符。

研究發現，通過抗氧化劑抑制心肌細胞的死亡，可以明顯阻止糖尿病的心臟毒性〔5〕，同時研究表明氧化應激在DCM的發病中起著重要作用，本研究結果提示總黃酮能夠增強STZ誘導的糖尿病大鼠心肌抗氧化能力，降低心臟氧化應激水平，保護糖尿病心臟。

心肌間質膠原纖維沉積和心肌纖維化是DCM的一種特征性病理改變，致心室收縮及舒張功能不全，最終導致心力衰竭〔6〕。多種細胞因子參與其發病過程，其中TGF-β1是關鍵的致心肌纖維化因子，DM時的高血糖、AngⅡ及胰島素抵抗等均可刺激TGF-β1分泌，增多后的TGF-β1能夠通過受體刺激心臟成纖維細胞合成Ⅰ型、Ⅲ型膠原及纖維連接蛋白(FN)，增加心肌組織ECM含量，同時下調蛋白水解酶活性，抑制纖溶酶原、膠原酶原、基質酶原等酶原激活物的產生，減少膠原降解，增加心肌細胞外基質的含量，促進心肌纖維化〔7〕。以上研究均表明TGF-β1在DCM的發生發展過程中起到重要作用，因此，抑制心肌TGF-β1表達能夠延緩糖尿病心肌損害。本實驗提示銀杏總黃酮能夠抑制DM大鼠心肌TGF-β1的表達。

1 An D，Rodrigues B.Role of changes in cardiacmetabolism in development of diabetic cardiomyopathy〔J〕.Am JPhysiol Heart Circ Physiol，2006;291(4):H1489-506.

2 季 華，季 強，吳玉珍.銀杏葉提取物在眼科及心血管疾病中的治療應用〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(11):1711-3.

3 方 芳.黃酮類天然藥物有效成分治療糖尿病及其并發癥研究進展〔J〕.中山大學研究生學刊(自然科學、醫學版)，2007;28(1):39-44.

4 Aneja A，TangWH，Bansilal S，etal.Diabetic cardiomyopathy:insights into pathogenesis，diagnostic challenges，and therapeutic options〔J〕.Am J Med，2008;121(9):748-57.

5 Li CJ，Zhang QM，Li MZ，et al.Attenuation ofmyocardial apoptosis by alphalipoic acid through suppression ofmitochondrial oxidative stress to reduce diabetic cardiomyopathy〔J〕.Chin Med J(Engl)，2009;122(21):2580-6.

6 Tang M，Zhong M，Shang Y，et al.Differential regulation of collagen typesⅠandⅢexpression in cardiac fibroblasts by AGEs through TRB3/MAPK signaling pathway〔J〕.Cell Mol Life Sci，2008;65(18):2924-32.

7 Khan R，Sheppard R.Fibrosis in heart disease:understanding the role of transforming growth factor-β1 in cardiomyopathy，valvular disease and arrhythmia〔J〕.Immunology，2006;118(1):10-24.

Effect of total ginkgo flavone-glycoides on the expression of transform ing grow th factor-β1 in myocardium of diabetic rats

ZHANG Cui，ZHANG Gen-Bao，ZHU Hai-Long.
Department of Pathophysiology，W annan M edical College，W uhu 241002，Anhui，China

ObjectiveTo explore the effects of total ginkgo flavone-glycoides on the oxidative stress and the expression of transforming growth factor(TGF)-β1 inmyocardium of diabetic rats.MethodsSD ratswere randomly divided:normal control，diabetesmodel and total ginkgo flavone-glycoides groups.Diabetesmodels were induced by STZ through intraperitoneal injection.Blood glucose，the activities of superoxide dismutase(SOD)and the content of malonaldehyde(MDA)in serum and myocardium were analyzed by biochemical methods.ELISA was used to detect the expression of TGF-β1 in myocardial tissue.The morphological changes of myocardium were checked through microscopy.ResultsCompared with diabetesmodel group，level of the blood glucose and the content of MDA were reduced，and the activities of SOD in serum and myocardium were increased in total ginkgo flavone-glycoides.Level of TGF-β1 in myocardium in total ginkgo flavone-glycoides group was dramatically decreased compared with that of diabetesmodel group.ConclusionsTotal ginkgo flavoneglycoides inhibits the expression of TGF-β1 inmyocardium of diabetic rats induced by STZ.Itmay play a protective effect onmyocardium of diabetic rats.

Total ginkgo flavone-glycoides;Diabetic cardiomyopathy;Transforming growth factor-β1;Oxidative stress

R587.2

A

1005-9202(2012)16-3467-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.055

安徽省教育廳自然科學研究重點項目基金(KJ2011A266);皖南醫學院中青年科研基金(WK201012)

張根葆(1957-)，男，碩士，教授，主要從事心血管病理生理學方面的研究。

張 翠(1981-)，女，碩士，講師，主要從事糖尿病及心血管病理生理學方面的研究。

〔2011-06-20收稿 2011-09-18修回〕

(編輯 曹夢園)