胰島素樣生長因子1對局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)功能及神經(jīng)細胞凋亡的影響

馬 莉 (沈陽醫(yī)學院附屬奉天醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽 110024)

胰島素樣生長因子1對局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)功能及神經(jīng)細胞凋亡的影響

馬 莉 (沈陽醫(yī)學院附屬奉天醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽 110024)

目的觀察胰島素樣生長因子-1對大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)細胞凋亡的影響。方法采用線栓法復制大鼠大腦中動脈栓塞模型，動物隨機分成胰島素樣生長因子-1組(IGF-1組)和對照組(control組)。對兩組大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分，采用TUNEL染色計數(shù)腦缺血周邊區(qū)神經(jīng)細胞凋亡數(shù)，免疫組織化學方法觀察BCL-2、Bax的蛋白表達。結(jié)果IGF-1組神經(jīng)功能缺損評分明顯低于control組，缺血周邊區(qū)的凋亡細胞明顯少于control組;但BCL-2蛋白免疫陽性細胞明顯多于control組，Bax蛋白免疫陽性細胞明顯少于control組。結(jié)論IGF-1可增加腦缺血之后缺血周邊區(qū)BCL-2蛋白的表達，減少Bax蛋白表達，拮抗神經(jīng)細胞凋亡，改善神經(jīng)功能。

胰島素樣生長因子1;神經(jīng)細胞凋亡;糖尿病;腦缺血

凋亡是腦梗死的重要病理環(huán)節(jié)，是影響患者恢復和預后的主要因素。采取相應措施抑制神經(jīng)細胞的凋亡，有可能阻止腦梗死缺血瀑布損傷的擴展，防止梗死的擴大，有利于患者神經(jīng)功能的恢復。胰島素樣生長因子-1(IGF-1)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，由70個氨基酸組成的多肽，在神經(jīng)組織的生長、分化、修復、再生中具有重要的作用，可能對腦缺血再灌注后細胞凋亡有重要作用，近年來倍受關(guān)注〔1～3〕。實驗擬觀察經(jīng)過IGF-1干預之后，局灶性腦缺大鼠的神經(jīng)功能和缺血周邊區(qū)神經(jīng)細胞凋亡數(shù)及BCL-2、Bax蛋白表達的變化，了解IGF-1干預腦缺血時神經(jīng)細胞凋亡的相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥片和試劑 IGF-1購自Santa Cruz公司，TUNEL試劑盒購于Roche公司，一抗為鼠抗人Bax及Bcl-2單克隆抗體購于Santa Cruz公司，鏈霉親合素-生物素-過氧化物酶復合物(SABC)免疫組織化學試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司，四氧嘧啶購于sigma公司。

1.1.2 實驗動物 40只Wistar大鼠，雌雄不限，200～250 g，SFP級別，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及干預 實驗動物隨機分成IGF-1組和對照組，每組20只。IGF-1組造模后每日頸部皮下注射 IGF-1 10μg/kg，對照組不造模只注射等量的生理鹽水。

1.2.2 模型的制備 參照文獻〔4〕方法，采用經(jīng)頸內(nèi)動脈線栓法制備大鼠右側(cè)大腦中動脈栓塞(MCAO)致局灶性永久性腦缺血模型。用質(zhì)量分數(shù)為2.5%戊巴比妥鈉(0.05 g/kg體重)腹腔注射麻醉，仰臥位固定。頸部左側(cè)正中切口，分離胸鎖乳突肌，切斷二腹肌前腹，暴露右側(cè)頸總動脈(CCA)，頸內(nèi)動脈(ICA)和頸外動脈(ECA)，將線栓從右側(cè)ECA殘端插入ICA;輕輕牽拉ECA殘端，使其與ICA成一條直線，調(diào)整線栓角度，使改良線栓弧度水平向外，與頸前正中線呈45°水平向外的夾角，移去夾閉ICA的蛙心夾，輕輕將線栓送入顱內(nèi)。實驗期間自由飲食、飲水，注意通風、干燥和清潔，保持安靜。

1.2.3 神經(jīng)功能缺損評分 采用文獻〔5〕中的神經(jīng)功能評分標準(NSS)分別于術(shù)后7、14 d對大鼠進行神經(jīng)功能評分。評分范圍0～18分，分數(shù)越高表明大鼠的神經(jīng)功能缺損越重。

1.2.4 細胞凋亡過氧化物酶標記測定試劑盒(TUNEL)檢測細胞凋亡 石蠟切片按照TUNEL試劑盒說明書操作，進行細胞凋亡染色。連續(xù)冠狀切片，片厚4μm。每個標本取兩張切片，光鏡(400倍)下觀察凋亡細胞，任意選不重疊的5個高倍視野，取平均值。細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，計數(shù)凋亡細胞數(shù)。

1.2.5 免疫組織化檢測 各組于術(shù)后7、14 d分別取10只大鼠，用10%水合氯醛麻醉，先后用肝素化生理鹽水及4%多聚甲醛心內(nèi)灌注，迅速斷頭取腦，以前囟為中心、冠狀面±1 mm切取腦片，置于4%多聚甲醛中后固定24 h，石蠟包埋，每隔100μm連續(xù)作6μm厚腦冠狀面石蠟切片。石蠟切片進行免疫組織化學染色檢測Bcl-2、Bax含量，具體步驟按照即用型SABC免疫組織化學試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)資料以±s表示，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損評分結(jié)果 IGF-1組7、14 d時神經(jīng)功能缺損評分明顯低于對照組，有顯著性差異(P＜0.01)。見表1。

2.2 TUNEL檢測結(jié)果 IGF-1組7 d和14 d有凋亡細胞存在，分別為53.41±3.76和38.93±3.22;對照組7 d和14 d凋亡細胞分別為92.42±4.60和119.36±4.54，對照組要多于IGF-1組(P＜0.01)，IGF-1組14 d少于7 d。

2.3 免疫組織化學染色結(jié)果 Bcl-2:兩組大鼠在腦缺血周邊區(qū)均有Bcl-2蛋白免疫陽性細胞，形態(tài)各異，有橢圓形細胞、球形細胞、梭形細胞等，但IGF-1組明顯高于對照組，IGF-1組14 d多于7 d。見圖1。Bax蛋白免疫陽性細胞的存在與BCL-2形態(tài)相近，但IGF-1組顯著低于對照組。見圖2。

表1 兩組大鼠神經(jīng)功能評分的比較(±s，n=10)

表1 兩組大鼠神經(jīng)功能評分的比較(±s，n=10)

與對照組比較:1)P＜0.05

組別7.29±0.46 5.48±0.63 IGF-1組 5.75±0.841) 4.02±0.721)7 d 14 d對照組

圖1 兩組Bcl-2免疫組織化學染色結(jié)果(×100)

圖2 兩組Bax免疫組織化學染色結(jié)果(×100)

3 討論

生長因子是一個大家族，IGF-1只是其中的一種。IGF-l系大腦發(fā)育所必需，且在腦缺血或(和)缺氧后再灌注等多種病理狀態(tài)下對機體發(fā)揮重要的保護作用。IGF-1及其受體在正常腦組織有少量表達，腦缺血發(fā)生后，腦組織IGF-1含量明顯增加，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分布也發(fā)生相應改變〔6〕。神經(jīng)功能缺損評定是一個重要的判定腦保護的指標，它是對神經(jīng)功能的一個綜合評價，是在動物個體的水平上對其運動功能、感覺功能及認知功能的定量評價，也是判定治療是否有效的最根本和最重要的標準，只有神經(jīng)功能缺損評分好轉(zhuǎn)，才能說明治療在臨床上可以改善癥狀，對于患者的預后有幫助〔7〕。本實驗結(jié)果顯示7、14 d IGF-l治療后神經(jīng)功能評分均明顯低于對照組，說明應用IGF-l能夠改善局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)功能，具有腦保護作用，而且14 d時要好于7 d，由于時間和條件限制，實驗未進行更長時間的觀察，但有實驗報道IGF-l的作用與應用時間呈正相關(guān)〔8〕。

TUNEL是目前國際上確定細胞凋亡的一種免疫組織化學染色方法，陽性細胞是正處于凋亡過程之中〔9〕。細胞凋亡是許多基因參與的程序化過程，有著非常復雜的調(diào)控機制，其中，Bcl-2基因家族是目前較為公認與凋亡密切相關(guān)的基因。大量實驗證實bcl-2基因具有抗凋亡作用，應用bcl-2基因治療大鼠局灶性腦缺血可以抑制神經(jīng)細胞的凋亡，減少梗死灶體積，改善大鼠神經(jīng)功能〔10〕。已知Bax是Bcl-2的同種性蛋白，二者之間的比例決定了細胞是生存還是凋亡，Bax高表達時，使細胞趨于凋亡，而當Bcl-2高表達時，對細胞凋亡則起抑制作用。兩項因子的作用呈相反的作用趨勢。

實驗結(jié)果表明IGF-1注射后凋亡細胞明顯減少，且14 d時比7 d時要少，而BCL-2蛋白的表達增多，14 d明顯多于7 d，但Bax蛋白的表達減少，IGF-1組明顯少于對照組，但7 d和14 d沒有顯著差別。總之，實驗結(jié)果驗證了IGF-1可以顯著降低腦神經(jīng)功能評分及減少神經(jīng)細胞凋亡，進而具有改善腦缺血性損傷的作用。

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9 王 峰，蘭希發(fā)，王海軍，等.胰島素樣生長因子1對糖尿病大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)細胞凋亡的影響〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復，2009;13(33):6469-73.

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R74

A

1005-9202(2012)16-3469-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.056

遼寧省科學計劃項目(No.2010-01)

馬 莉(1969-)，女，主任醫(yī)師，主要從事腦血管疾病的臨床診治研究。

〔2012-01-06收稿 2012-03-20修回〕

(編輯 袁左鳴)