中藥中玉米赤霉烯酮的殘留測(cè)定

毛 丹，許 勇，鄭 榮，陳 鈳，王 柯，季 申

(上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海201203)

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)，又稱F2毒素，它首先從有赤霉病的玉米中分離得到，是由禾谷鐮刀菌(F.graminearum)和三線鐮刀菌(F.tricinctum)等鐮刀菌屬產(chǎn)生，主要污染玉米、小麥、大米、大麥等谷物.玉米赤霉烯酮具有生殖毒性、血液毒性、細(xì)胞毒性、免疫毒性和遺傳毒性，可導(dǎo)致生殖障礙、消化系統(tǒng)功能紊亂［1］.玉米赤霉烯酮廣泛存在于霉變的玉米、高粱、小麥等谷類作物和奶制品中，A.K.ROY等人從蒺藜等六種草藥中檢測(cè)到了玉米赤霉烯酮［2］，而Trucksess MW等人則曾報(bào)道過(guò)玉米赤霉烯酮存在于干燥人參的根粗提物中［3］.為此，建立中藥中玉米赤霉烯酮的檢測(cè)方法，不僅可以確保人民用藥安全，也可以為監(jiān)督執(zhí)法提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐.

目前玉米赤霉烯酮的分析測(cè)定方法基本應(yīng)用于食品領(lǐng)域，一般采用薄層色譜法(TLC)、酶聯(lián)吸附免疫法(ELISA)和高效液相色譜法(HPLC)［4～8］.TLC法繁瑣、耗時(shí)、靈敏度低，進(jìn)行目視定量時(shí)主觀性影響較大，且測(cè)定時(shí)大量接觸到ZEN標(biāo)準(zhǔn)品，不利于實(shí)驗(yàn)人員的健康保護(hù).而ELISA法適用于大量樣品的篩選和普查，但由于酶本身的不穩(wěn)定性，用此方法進(jìn)行玉米赤霉烯酮的檢驗(yàn)有可能帶來(lái)假陽(yáng)、陰性結(jié)果，難以達(dá)到定量的相關(guān)技術(shù)要求.目前食品中比較常用的玉米赤霉烯酮高效液相色譜測(cè)定方法，采用免疫親和柱進(jìn)行供試品溶液的凈化，由于免疫親和柱對(duì)玉米赤霉烯酮具有專屬性吸附，出現(xiàn)假陽(yáng)性的情況少.本文鑒于中藥基質(zhì)的復(fù)雜性，經(jīng)實(shí)驗(yàn)摸索研究，建立了中藥中免疫親和凈化－高效液相色譜的測(cè)定方法，若有陽(yáng)性樣品，則采用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行確證.該方法重復(fù)性好、回收率高、簡(jiǎn)便靈敏，可作為中藥中玉米赤霉烯酮的測(cè)定方法.

1 儀器與材料

高速均質(zhì)器(德國(guó)IKA公司提供，轉(zhuǎn)速采用12 500 r?min－1);玉米赤霉烯酮免疫親和柱(美國(guó)VICAM公司);美國(guó)AgiLent 1100高效液相色譜儀，熒光檢測(cè)器;玉米赤霉烯酮對(duì)照品(ALEXIS公司提供，Lot:L16748/b).薏苡仁、麥芽、綠豆藥材均由華宇藥材有限公司提供，經(jīng)上海市食品藥品檢驗(yàn)所鑒定.

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Inertsil ODS－3柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈 －水(50∶50)，流速1.0 mL?min－1，以熒光檢測(cè)器檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)232 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm，柱溫:30℃，各色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，結(jié)果見(jiàn)圖1.

圖1 高效液相色譜圖

2.2 供試品溶液的制備 取樣品粉末40 g(過(guò)二號(hào)篩)，精密稱定，置均質(zhì)杯中，加入氯化鈉4 g，精密加入90%乙腈100 mL，高速攪拌2 min，離心5 min(離心速度4 000 r?min－1)，精密吸取上清液10 mL，用水稀釋至50 mL，搖勻，離心，精密吸取上清液10 mL，通過(guò)免疫親合柱(流速3 mL?min－1)，隨后用水10 mL洗脫(流速6 mL?min－1)，洗脫液棄去，精密量取1.5 mL甲醇洗脫(流速1 mL?min－1)，收集甲醇洗脫液，置2ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得.

2.3 線性關(guān)系考察 精密稱取玉米赤霉烯酮對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含250 ng的溶液，作為對(duì)照品溶液(1).精密吸取對(duì)照品溶液(1)1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液(2).分別精密吸取上述對(duì)照品溶液(1)2 μL、5 μL、10 μL、15 μL，對(duì)照品溶液(2)5 μL、10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積.以進(jìn)樣量(pg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計(jì)算，回歸方程為:Y=1.970 7×10－2X－1.273 66×10－1，r=0.999 83(n= 6);結(jié)果表明，玉米赤霉烯酮在進(jìn)樣量為125～375 0 pg范圍內(nèi)峰面積與進(jìn)樣量線性關(guān)系良好.

2.4 進(jìn)樣精密度試驗(yàn) 精密吸取上述對(duì)照品溶液(1)，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定，計(jì)算玉米赤霉烯酮色譜峰面積的RSD為0.7%，結(jié)果表明儀器精密度良好.

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取薏苡仁陽(yáng)性樣品粉末40 g(過(guò)二號(hào)篩)，一式6份，精密稱定，，按供試品溶液的制備項(xiàng)下依法操作，進(jìn)樣分析，計(jì)算RSD為5.2%，表明重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果良好.供試品溶液采用LC－MS－MS進(jìn)行陽(yáng)性確證，結(jié)果供試品溶液中定性離子的豐度比與對(duì)照品溶液中定性離子的豐度比相接近(見(jiàn)表1).

表1 質(zhì)譜確證結(jié)果

2.6 回收率試驗(yàn) 取本品粉末(過(guò)二號(hào)篩)40 g，精密稱定，一式3份，按低、中、高三種濃度水平分別精密加入玉米赤霉烯酮對(duì)照品1 μg、2.5 μg及7.5 μg，依法制備供試品溶液并測(cè)定含量，計(jì)算平均回收率(見(jiàn)表2)，結(jié)果表明回收率試驗(yàn)結(jié)果良好.

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取重復(fù)性試驗(yàn)用樣品，每隔5 h進(jìn)樣分析，記錄峰面積并計(jì)算RSD為3.0%，結(jié)果表明，在0～25 h之內(nèi)，供試品溶液保持穩(wěn)定.

2.8 檢測(cè)限 測(cè)定低濃度回收率供試品溶液的信噪比，以信噪比3∶1計(jì)算得本方法檢測(cè)限為15 μg?kg－1，以信噪比10∶1計(jì)算得本方法定量限為50 μg?kg－1.

2.9 樣品測(cè)定

2.9.1 國(guó)際實(shí)驗(yàn)室能力測(cè)試結(jié)果 按照本實(shí)驗(yàn)所述方法參加由英國(guó)實(shí)驗(yàn)室CSL主辦的能力驗(yàn)證測(cè)試項(xiàng)目，結(jié)果為滿意.

2.9.2 樣品測(cè)定結(jié)果 對(duì)上述3種共計(jì)11批樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果4批薏苡仁均檢出玉米赤霉烯酮，結(jié)果分別為325 μg?kg－1、30 μg?kg－1、268 μg?kg－1、178 μg?kg－1.

2.10 確證實(shí)驗(yàn) 供試品溶液制備方法中使用的免疫親和柱對(duì)玉米赤霉烯酮具有專屬性吸附，因此一般情況下供試品溶液的高效液相色譜圖比較干凈，出現(xiàn)假陽(yáng)性的情況比較少.筆者在近幾年的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著監(jiān)測(cè)品種范圍和檢驗(yàn)樣品數(shù)量的擴(kuò)大，某些基質(zhì)復(fù)雜的樣品，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性的情況.因此進(jìn)一步的確證實(shí)驗(yàn)就顯得非常必要.通常，建議通過(guò)改變色譜條件比如更換儀器和色譜柱，調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例等手段進(jìn)行考察.有條件的實(shí)驗(yàn)室，則應(yīng)通過(guò)LC－MS進(jìn)行確證.

本實(shí)驗(yàn)采用LC－MS－MS對(duì)上述陽(yáng)性樣品進(jìn)行了確證實(shí)驗(yàn).色譜柱為Acquity Uplc Beh C18(1.7 μm，2.1 mm×100 mm);以甲醇為流動(dòng)相A相，以0.01%甲酸為流動(dòng)相B相，流速0.3 mL?min－1，按表3方法進(jìn)行梯度洗脫.

表3 流動(dòng)相梯度

離子源為電噴霧離子化源ESI(－)源;毛細(xì)管去簇電壓、碰撞池能量等質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表4.

表4 質(zhì)譜參數(shù)表

3 討論

3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

3.1.1 波長(zhǎng)的選擇 分別考察了:①激發(fā)波長(zhǎng)232 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm;②激發(fā)波長(zhǎng)274 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm;③激發(fā)波長(zhǎng)274 nm，發(fā)射波長(zhǎng)440 nm.結(jié)果以激發(fā)波長(zhǎng)232 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm所得色譜峰峰面積最大，峰高最高.

3.1.2 流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇 分別考察了:①乙腈 －水(50∶50);②乙腈－水－甲醇(46∶46∶8);③1%磷酸溶液－甲醇－乙腈(40∶30∶30)3種流動(dòng)相，對(duì)稱因子分別為0.83、0.66、0.70.故選用對(duì)稱因子較好且毒性相對(duì)較小的乙腈－水(50∶50)為流動(dòng)相.

3.1.3 色譜柱的選擇 分別考察了:①I(mǎi)ntersil－ODS3(4.6 mm×150 mm，5 μm);②Agilent CB－C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);③Waters C18(2.1 mm ×150 mm，5 μm)3種色譜柱，對(duì)稱因子分別為0.95、0.74、0.88，色譜柱①的對(duì)稱因子相對(duì)較好，本次實(shí)驗(yàn)選擇色譜柱①進(jìn)行研究.

3.2 供試品溶液制備方法的考察

3.2.1 提取過(guò)程 為有效的提取出玉米赤霉烯酮成分，對(duì)供試品溶液制備方法中提取溶劑、提取方式、提取時(shí)間等分別進(jìn)行了考察.試驗(yàn)中對(duì)提取溶劑進(jìn)行選擇時(shí)，分別篩選了90%乙腈、90%甲醇、50%乙腈、50%甲醇4種溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用90%乙腈勻漿提取2 min效率最高，故被采用.

3.2.2 凈化過(guò)程 為得到較好的色譜分離效果，采用可以特效性分離出玉米赤霉烯酮的免疫親和柱對(duì)3.2.1中提取液進(jìn)行凈化，同時(shí)對(duì)淋洗液及洗脫溶劑進(jìn)行了選擇.其中對(duì)淋洗液的種類(淋洗緩沖液和水)及用量分別進(jìn)行了考察，本次試驗(yàn)選用的3種藥材(麥芽、綠豆和薏苡仁)用水10 mL淋洗即可除去雜質(zhì)干擾，得到滿意的色譜分離效果;若其他樣品中出現(xiàn)干擾雜質(zhì)特別多的情況，可以先用5 mL淋洗緩沖液洗脫，再用5 mL水洗脫.

3.2.3 濃縮過(guò)程 氮吹為濃縮過(guò)程的常用方法.本次試驗(yàn)比較了氮吹與不氮吹的效果，結(jié)果表明，氮吹與否并不影響最終測(cè)定結(jié)果.氮吹步驟相對(duì)繁瑣，因此在玉米赤霉烯酮含量可以滿足色譜分析需求的情況下則不采用氮吹的步驟.若玉米赤霉烯酮含量過(guò)低，無(wú)法滿足檢測(cè)靈敏度要求時(shí)，可通過(guò)氮吹方式進(jìn)行濃縮，以得到滿意的測(cè)定結(jié)果.

3.3 確證實(shí)驗(yàn) 鑒于中藥基質(zhì)的復(fù)雜程度，若采用免疫親和凈化－高效液相色譜法測(cè)定玉米赤霉烯酮的結(jié)果為陽(yáng)性，則建議采用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行進(jìn)一步確證.

3.4 中藥中玉米赤霉烯酮的限量 目前國(guó)內(nèi)外暫無(wú)中藥中玉米赤霉烯酮的限量標(biāo)準(zhǔn)，而在食品標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)玉米赤霉烯酮的限量則有嚴(yán)格的規(guī)定.歐盟規(guī)定除玉米粉外的谷粉限量為75 μg?kg－1.巴西規(guī)定玉米中限量為200 μg?kg－1，奧地利規(guī)定小麥中限量為60 μg?kg－1.我國(guó)規(guī)定谷物及其制品如小麥、小麥粉、玉米、玉米面(渣、片)中玉米赤霉烯酮的限量標(biāo)準(zhǔn)為60 μg?kg－1［9］，飼料中玉米赤霉烯酮的限量標(biāo)準(zhǔn)為500 μg?kg－1［10］.鑒于玉米赤霉烯酮易滋生于谷物類產(chǎn)品，參照上述的玉米赤霉烯酮限量標(biāo)準(zhǔn)，建議將中藥中玉米赤霉烯酮的限度規(guī)定為60 μg?kg－1.

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