及時檢測孢子蟲寄生挽救蜂群

及時檢測孢子蟲寄生挽救蜂群

近年來，我們這些從事蜜蜂工作的人，在養蜂實踐上經歷了重要的變化，保持蜜蜂健康似乎將蜂群常規管理轉變成蜂群生存斗爭。一些問題可以用新疾病或產生抗藥性的微生物加以說明。在蜂巢內外增加應用合成的殺蟲劑沒有幫助，不同殺蟲劑的混合（即便單獨應用時它們對蜜蜂沒有劇毒）能夠影響蜜蜂的健康和免疫反應，產生不可預料的結果，使蜂群容易感染各種疾病。

由于正在受到喪失重要授粉者的威脅，美國國會批準增加蜜蜂研究經費，發現蜂群下降的原因。科學家正在尋找蜂群衰竭失調（CCD）綜合征的根本原因，探索新疾病、有害化合物或危害蜂群的各種因素，以便使蜂群恢復健康。許多這樣的緊迫問題將安排在美國農業部新的研究協作計劃（CAP），系統地分析從定地蜂場采集的蜜蜂、花粉和蜂蠟。

被鑒定的可疑點如此之多，蜜蜂病毒和微孢子蟲已經引起特別的關注。它們大部分是細胞內寄生，肉眼檢查蜂群不能檢測到。蜜蜂最終表現出疾病癥狀時，大部分蜜蜂被感染以致死亡，大多數情況下挽救蜂群已經太晚了。

至少在上世紀50年代，在美國就已經有蜜蜂微孢子蟲，但是它出現在蜜蜂上是個混淆的問題。發現在蜂箱前爬行的染病蜂遺留下下痢的黃色帶（糞便），通常使用抗生素治療。為什么現在科學家對近年發生的蜂群損失懷疑微孢子蟲？有的甚至指出蜜蜂微孢子蟲是蜂群衰竭失調的主要原因。顯然，微孢子蟲的一個新種，東方蜜蜂微孢子蟲（Nosema ceranae）現在廣泛分布在美國及全世界，悄悄地取代著蜜蜂微孢子蟲（Nosema apis）。在1966年幾乎沒有被發現，但是在2005年觀察到亞洲蜜蜂遭受這種疾病時重新引起關注。2006年，在歐洲檢測到東方蜜蜂微孢子蟲，使西班牙、法國、德國及瑞士的蜂群遭受到嚴重損失。因為這個新種在蜂場不容易檢測，在不知不覺感染了好長時間。蜜蜂可能感染了幾個星期不顯示臨床癥狀。這兩種微孢子蟲孢子在顯微鏡下觀察非常相似，顯微鏡鑒定這個新種也是挑戰。為了鑒定，蜜蜂樣本通常送到能進行脫氧核糖核酸擴增的實驗室，科學家采用聚合酶鏈反應（PCR）確定這兩種微孢子蟲的基因不同。感染東方蜜蜂微孢子蟲的蜂群死亡非常迅速，蜂群生存取決于及時的檢測和治療。然而，等待實驗室的結果喪失了寶貴的時間。因此，開發快速簡單的檢測工具，能夠挽救整個蜂場，預防疾病的流行。

一、纖維素試紙測定

這種想法并不新鮮，是根據免疫學原理（抗體蛋白的相互作用）研制的。它們時常被設計成纖維素試紙的形式，以便在野外和家庭中使用。雖然，基于抗體的纖維素試紙測定是通過研發制成復雜的技術，實際的產品裝備成一個試劑盒，使用方便。這種方法是在醫學上應用，最熟悉的是人的妊娠試驗。

為了使這種技術適應養蜂業的需要，將要開發一種簡單無誤的方法，檢測蜜蜂樣本中的微孢子蟲感染。這項研究作為CAP的一部分正在美國農業部農業研究中心的蜜蜂研究室（HBRU）執行，將與私人生物技術公司合作。

二、試劑盒工作原理

試劑盒含有多條纖維素試紙，每一條使用一次。將壓碎的蜜蜂或從多只蜜蜂解剖出來的中腸放入有試劑的玻璃瓶中，把一條纖維素插入勻漿里。過一會將出現一條或兩條色帶。如果只看到一條藍色帶（對照），見圖1-1A（-）指示為陰性結果。如果看到兩條帶，指示為陽性結果，一條藍色帶為對照，另一條紅色帶指示目標微孢子蟲蛋白質，見圖1-1A（+）。

東方蜜蜂微孢子蟲抗體（Ab）結合到纖維素條帶上，作為一個“紅旗”和一個為免疫原（微孢子蟲蛋白質）的固位槽。免疫反應是微孢子蟲抗體和微孢子蟲蛋白質之間的非常強的結合（圖1-1B）。微孢子蟲孢子加入反應混合物中時，微孢子蟲抗體將與微孢子蟲蛋白質結合，形成非常牢固的帶。如果這種反應采用第二抗體（抗體檢測者）與顏色檢測兩者結合，則出現兩條顏色帶（對照和具體的微孢子蟲）指示有微孢子蟲孢子。顯示一條顏色帶（對照）指示陰性結果。

這種檢測法的基本思想不是新的，從前許多人想開發這種測定方法。然而，主要的困難是，抗體質量不佳，缺乏特異性，敏感性差，阻礙成功地開發出一種快速的測試方法。抗體通常是通過將一種外來的蛋白質（免疫原）注射到山羊、兔子或老鼠等動物體內。動物的免疫系統檢測到外來蛋白質的入侵，反應產生抗體。很明顯，抗體的質量左右免疫試樣的成敗。抗體檢測的好壞要看原來的免疫原的型式和純度而定。

在實驗室生產免疫原時，時間、努力和它的合成物需要的資源是巨大的。制造純凈的免疫原是個挑戰。污染的分子可成為第二免疫原，結果抗體缺乏特異性。我們決定選擇一種新方法，所謂的基因抗體技術（GAT）（圖2）來避免這種錯誤。采用這種技術完全是關于免疫原的新思路。采用基因抗體技術，是將含有目標（在我們的例子是微孢子蟲）脫氧核糖核酸序列編碼蛋白質的一段環形的脫氧核糖核酸（質粒）注入動物，然后在動物體內（通過動物）直接產生純的蛋白質，從而避免在實驗室正常長度蛋白質的生產過程。在活體內表達的蛋白質被動物視為外來的入侵者，轉而觸發產生抗體并釋放到動物血液中。

采用基因抗體技術的一個困難是首先需要知道蛋白質順序。這有一系列阻礙，除非病原的基因組已經測序。很幸運，美國農業部正在給兩種微孢子蟲測序。我們將能夠測定位于東方蜜蜂微孢子蟲孢子壁的目標蛋白質的順序（美國農業部農業研究中心貝爾茨維里蜜蜂研究室Dr.Jay Evans提供DAN順序）。現在正在對蜜蜂樣本測試新的東方蜜蜂微孢子蟲抗體。至今我們的測試顯示很高的抗體敏感性，在稀釋1∶5000的粗蜜蜂勻漿能檢測微孢子蟲孢子，與商業生產的抗體（的靈敏度）相似。這種方法也能檢測低量的孢子。采用常規的實驗室凝膠方法，確定新抗體能在1000只無感染的蜜蜂中檢測出1只感染蜜蜂。這種水平的敏感度能夠在蜂群中檢測非常低的感染率。

三、試劑盒的應用

這種測驗不是要取代實驗室通用的方法。不需要取代為處理大量樣本設計的高生產率技術。它會幫助養蜂人、養蜂愛好者以及商業養蜂者在野外檢測和監視疾病的進程。它能幫助養蜂人關于處理疾病做出理智的決定。最重要的是，這種新檢測工具優點有：（1）能夠減少不必要的治療，降低抗生素的使用；（2）為管理者在處理國內外蜜蜂移動方面有一個新的做出決定的工具；（3）蜂王和籠蜂生產者可檢測和監視他們的生產群微孢子蟲水平。

黃文誠 譯自《美國蜜蜂》雜志2010第1期