毛細管GC法測定南五味子多糖的單糖組成Δ

姚 丹，王宏軍，楊嘉玉，雷明生（遼寧醫(yī)學院，遼寧 錦州 121001）

毛細管GC法測定南五味子多糖的單糖組成Δ

姚 丹＊，王宏軍#，楊嘉玉，雷明生（遼寧醫(yī)學院，遼寧 錦州 121001）

Δ遼寧省教育廳科學技術(shù)研究項目（L2010256）

＊實驗師。研究方向：藥物分析與儀器分析。電話：0416-4672307。E-mail：yaodan88abc@163.com

#通訊作者：副教授，博士。研究方向：藥物分析與飼料分析。電話：0416-4672096。E-mail：wanghj0312@yahoo.com.cn

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.23.18

目的：研究南五味子多糖中單糖的種類和組成比例。方法：以2moL·L－1硫酸溶液水解南五味子多糖，用吡啶溶解干燥的水解產(chǎn)物，硅烷化衍生；采用毛細管氣相色譜法測定南五味子多糖的單糖組成：色譜柱為SE-30石英毛細管（30m×0.25mm× 0.25μm），進樣口溫度為220℃，檢測器溫度為230℃，柱溫為195℃。結(jié)果：南五味子多糖中含有甘露糖、木糖、半乳糖、果糖、葡萄糖和半乳糖醛酸6種單糖成分，已確定的6種單糖的摩爾比為19.78∶2.75∶0.149∶1∶0.381∶0.127。結(jié)論：該方法簡便、靈敏，可以準確測定出南五味子多糖中含有的各種單糖。

毛細管氣相色譜法；大葉南五味子；多糖；單糖組成

多糖是生命代謝不可缺少的重要物質(zhì)，是多個單糖或其衍生物聚合而成的大分子活性化合物。近年來研究表明，五味子多糖具有保肝[1]、抗衰老[2]、抗腫瘤[3，4]、調(diào)節(jié)免疫[5]、降血脂[6]、鎮(zhèn)痛[7]等藥理作用。一般來說，多糖所具有的藥理活性是與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)的[8，9]，故對多糖的單糖組成和摩爾比的測定是研究多糖性質(zhì)的一項較為重要的工作。苯酚-硫酸法是常用的測量多糖總含量的方法[10]，而毛細管氣相色譜（GC）法是目前測定多糖中單糖組成和摩爾比的常用方法。大葉南五味子（Kadsuramarmorata）屬于五味子科南五味子屬植物。前期研究表明，從該植物中制備的南五味子多糖（KPS）具有增強細胞免疫和體液免疫的作用[11]，但關(guān)于該植物中多糖的分離純化和結(jié)構(gòu)研究均未見報道。故本試驗采用硅烷化衍生，用毛細管GC法測定了從大葉南五味子果實中分離到的KPS的單糖組成及摩爾比，以期為該植物的開發(fā)提供理論和試驗數(shù)據(jù)，為其藥理活性、作用機制的研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

GC-2010plus GC儀、氫火焰離子化檢測器（FID）（日本島津公司）；安瓿熔封儀（中南制藥機械廠）；TG16-W微量高速離心機（湘儀離心機制造廠）；DHG-9245A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；FA1004N電子天平（上海精密科學儀器有限公司）。

大葉南五味子產(chǎn)于貴州，由貴州中醫(yī)院饋贈并鑒定為真品。甘露糖（分析純，天津虔誠偉業(yè)科技發(fā)展有限公司）；D（-）阿拉伯糖（生物試劑，上海晶純試劑有限公司）；L-鼠李糖、D-核糖、D-木糖（生物試劑，上海惠世生化試劑有限公司）；D-果糖（生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)責任有限公司）；半乳糖（生物試劑，鄭州興人精細化工有限公司）；葡萄糖（分析純，天津市北方天醫(yī)化學試劑廠）；D（+）-半乳糖醛酸（生物試劑，國藥集團化學試劑有限公司）；甘露醇（鄭州百合化工產(chǎn)品有限公司）；硫酸為高純試劑，無水吡啶、六甲基二硅胺烷、三甲基氯硅烷、碳酸鋇（BaCO3）、無水乙醇均為分析純。

2 方法

2.1 KPS的制備

精密稱取大葉南五味子100 g，利用水提醇沉法提取多糖[12]，經(jīng)三氯乙酸脫蛋白、活性炭脫色純化[13]后得到KPS，備用。

2.2 多糖的水解

精密稱取KPS 50.0mg，置于安瓿中，加入2moL·L－1硫酸溶液5m L，酒精噴燈真空封管，置于烘箱里以110℃水解8 h，取出冷卻至室溫后加入BaCO3粉末，靜置過夜，待中和至中性，以10 000 r·min－1離心5min除去沉淀，取上清液，冷凍干燥后得到多糖水解產(chǎn)物，備用[14]。

2.3 標準單糖硅烷化衍生

分別稱取9種標準單糖各5.0mg、內(nèi)標物甘露醇2.0mg，60℃干燥至恒重，加入無水吡啶1m L，75℃溶解30m in，再加入0.6m L硅烷化試劑（六甲基二硅胺烷∶三甲基氯硅烷＝2∶1），搖勻[14]，60℃反應(yīng)10m in，10 000 r·m in－1離心10m in后，取上清液，備用。

2.4 色譜條件

色譜柱：SE-30彈性石英毛細管柱（30m×0.25mm×0.25 μm）；檢測器：FID；柱溫：195℃；進樣口溫度：220℃；檢測器溫度：230℃；分流比：80∶1；載氣：高純氮氣，流速：30m L·m in－1；進樣量：1.0μL。

2.5 多糖衍生物的制備

稱取10.0mg徹底干燥的水解產(chǎn)物與2.0mg甘露醇，按“2.3”項下方法衍生化，10 000 r·m in－1離心5m in后取上清液進行GC分析。以內(nèi)標法定性分析KPS的化學組成。

2.6 相對校正因子和摩爾比的測定

2.6.1 相對校正因子 相對校正因子的計算公式為f＝（Wi×As）/（Ws×Ai）。式中，Wi為標準單糖的質(zhì)量；Ws為內(nèi)標物的質(zhì)量；Ai為標準單糖的峰面積；As為內(nèi)標物的峰面積[15]。

2.6.2 摩爾比 根據(jù)下列公式求得各單糖的摩爾數(shù)，即N＝（Ax×Mr）/（As×f）。式中，N為單糖的物質(zhì)的量；Ax為單糖的峰面積；As為內(nèi)標物的峰面積；f為該單糖的校正因子；Mr為該單糖的分子量[15]。進而求得多糖水解產(chǎn)物中的單糖摩爾比。

3 結(jié)果與分析

3.1 混合標準單糖衍生物GC分析

混合標準單糖中各單糖的定性是通過與每個單糖的保留時間作對比確定的。混合標準單糖衍生物的GC圖見圖1；各標準單糖的保留時間見表1。

圖1 混合標準單糖衍生物的GC圖Fig 1 GC chromatogram of m ixed standard monosaccharides derivative

表1 各標準單糖的保留時間（m in）Tab 1 Retention timeof standardmonosaccharides（m in）

由圖1可知，采用硅烷化衍生法，只有葡萄糖和甘露糖對應(yīng)一種衍生化產(chǎn)物，其他單糖則對應(yīng)多個衍生物；各單糖與內(nèi)標物能完全分開。在上述GC條件下，混合標準單糖中各種單糖衍生物均可以得到較好的分離。

3.2 KPS水解衍生化產(chǎn)物GC分析

在與混合標準單糖同樣的反應(yīng)和測定條件下，進行KPS水解產(chǎn)物硅烷化衍生物的毛細管GC分析。將樣品的混合單糖衍生物色譜峰與標準單糖衍生物色譜峰經(jīng)GC-solution軟件比對，鑒定相應(yīng)單糖的色譜峰，詳見圖2。

圖2 KPS水解衍生化產(chǎn)物的GC圖Fig 2 GC chromatogram sof hydrogen derivative from KPS

由圖2可知，從大葉南五味子果實中獲得的KPS含有甘露糖、木糖、半乳糖、果糖、葡萄糖和半乳糖醛酸；保留時間分別為12.730、14.723、15.264m in的峰為未知物峰。

3.3 KPS中單糖摩爾比的計算

根據(jù)單糖和內(nèi)標物的峰面積，按照公式分別計算各種單糖標準品相對于內(nèi)標物的校正因子。以KPS中各種單糖及內(nèi)標的峰面積和單糖各自的校正因子來計算KPS中各種單糖的摩爾比。經(jīng)過計算，得到KPS中已確定的6種單糖——甘露糖、木糖、半乳糖、果糖、葡萄糖和半乳糖醛酸的摩爾比為19.78∶2.75∶0.149∶1∶0.381∶0.127。

4 討論

糖類衍生化后進行GC分析有多種方法，其中糖腈乙酸酯衍生物GC法具有衍生物制備簡便、試劑易得等優(yōu)點，而且每種單糖得到單一的色譜峰，這一點對未知結(jié)構(gòu)多糖的分析是十分重要的。

分析多糖中的單糖組成，首要工作就是將多糖樣品進行徹底的水解。因為如果水解效果不理想，多糖很難完全水解為單糖或者僅僅有很少部分水解，會導致樣品水解衍生化產(chǎn)物在GC分析中峰值很小，從而影響多糖中含量較少的單糖的測定。通過對影響水解效果的各種因素的考察分析，筆者認為對于KPS的水解采用2moL·L－1硫酸溶液水解8 h較為合適。用BaCO3中和處理時借助超聲波能極大縮短中和時間，減少BaCO3的消耗，離心除去沉淀可防止對樣品的損耗。三氟乙酸（TFA）也可用于多糖的水解，但因其具有揮發(fā)性、腐蝕性，故本試驗未選擇TFA水解KPS。

筆者曾經(jīng)對比了SE-30不銹鋼柱和SE-30毛細管柱對單糖的分離效果，發(fā)現(xiàn)SE-30毛細管柱的分離效果較好，信號值高，且無需程序升溫亦可使各種單糖較好的分離、測定。由于毛細管GC進樣量少，容易帶來體積誤差，故筆者采用內(nèi)標法進行分析測定，可以校正吸量誤差并保留時間的重現(xiàn)性，使結(jié)果更為準確、可靠。

由于自然界中存在的單糖種類較多，有些單糖很難得到標準品，因此本試驗只能確定出KPS中含有的6種單糖。圖2中的另外3個峰可能為未知單糖或其他雜質(zhì)，尚需進一步確證；但從GC分析結(jié)果來看，鼠李糖、阿拉伯糖和木糖等五碳糖比甘露糖和葡萄糖等六碳糖早出峰，因此可以推測未知3個峰如果是單糖則可能為五碳糖。

綜上，該方法簡便、靈敏，可以準確測定出南五味子多糖中含有的各種單糖。

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Analysis of M onosaccharides Com position in Polysaccharide fromKasura marmorataby Capillary Gas Chromatography

YAO Dan，WANG Hong-jun，YANG Jia-yu，LEIM ing-sheng（Liaoning Medical University，Liaoning Jinzhou 121001，China）

OBJECTIVE：To study the types and proportion of monosaccharides inKasura marmoratapolysaccharide.METHODS：K.marmoratapolysaccharide was hydrolyzed w ith 2 moL·L－1sulfuric acid.The dried hydroxlyslate was dissolved in pyridine，and derived by silane.Themonosaccharides inK.marmoratapolysaccharide were determ ined by capillary GC.The determ ination was performed on SE-30（30 m×0.25 mm×0.25μm）capillary column.Injection and detector temperature was 220℃ and 230℃ respectively.The column temperature was 195℃.RESULTS：K.marmoratapolysaccharide made up of six monosaccharides，such as mannos，exylose，galactose，fructose，glucose，galacturonic acid.The mole proportion of mannose-xylose-galactose-fructose-glucose-galacturonic acid was 19.78∶2.75∶0.149∶1∶0.381∶0.127.CONCLUSION：Themethod reported in this paper is simple and sensitive，which can be used for determ ination ofmonosaccharides composition inK.marmoratapolysaccharide.

Capillary gas chromatography；Kadsuramarmorata；Polysaccharide；Monosaccharides composition

R284.1；R917

A

1001-0408（2012）23-2158-03

2011-12-12

2012-02-05）