國內外實驗動物病毒檢測的比較

佟巍

（中國醫學科學院北京協和醫學院醫學實驗動物研究所，北京 100021）

實驗動物病毒學檢測是確保實驗動物質量的有效措施之一，國外許多實驗動物機構都建有自己的病毒學質量監測體系，我國實驗動物病毒學檢測技術和監測能力也不斷發展，達到了一定的標準化水平［1］。然而隨著生命科學研究不斷發展，實驗動物病毒檢測工作的不斷深入，發現實驗動物病毒檢測內容、檢測方法、檢測能力和檢測試劑等仍存在諸多問題。本文以常用實驗動物（包括大鼠、小鼠、猴以及實驗用小型豬）為代表，介紹國內外實驗動物病毒檢測項目的異同。

1 實驗動物病毒學檢測檢測內容的比較

1.1 小鼠、大鼠病毒學檢測內容比較

小鼠、大鼠在各種實驗研究中用量最大，用途最多。許多國家和地區都建立了嚙齒類實驗動物的專門機構進行著實驗動物和動物實驗的各方面科學研究工作，并制定了嚙齒類實驗動物的病毒學控制標準［2-5］（表1）。

表1 SPF級嚙齒類實驗大鼠、小鼠病毒學標準對比Tab.1 Comaprison of virological standards for SPF rats and mice

1.2 猴病毒檢測內容比較［3，7，8］

歐洲FELASA以及日本筑波靈長類動物研究中心對非人靈長類的病毒學檢測都有較高的標準。特別是FELASA對常用的食蟹猴、恒河猴、綠猴、狒狒、松鼠猴、狨猴，也包括猩猩，都有自己特定的病毒學控制要求，值得我國參考（表2）。

表2 SPF級非人靈長類實驗動物病毒學質量標準對比Tab.2 Comparison of virological standards for SPF non-human primate laboratory animals

1.3 小型豬病毒檢測內容比較

我國生物醫學科學事業的發展使實驗用小型豬得到了越來越廣泛的應用，因而對標準化的實驗用豬提出了更高要求。我國目前尚無國家標準，北京、上海相繼出臺了小型豬的實驗動物地方標準。臺灣省規定SPF豬應排除的病毒僅為：Herpes virus （Aujeszky＇s virus）、Coronavirus（TGE）、PRRS virus。歐洲各國、瑞典和美國實驗動物中心對于豬病毒健康監控內容也不盡相同［9］（表3）。

表3 SPF級小型豬病毒學質量標準對比Tab.3 Comparison of virological standards for SPFminipigs

以上舉例介紹了大、小鼠，猴和小型豬的檢測內容比較，其他實驗動物也存在類似情況，應引起同樣重視。

2 實驗動物病毒檢測方法

實驗室檢查主要分為血清學診斷和病原學檢查［10］，目前國內外實驗動物病毒檢測多采用血清學檢測方法。由于方法簡便快速，對儀器設備要求不高，測定成本低廉等優點，被廣泛應用于實驗動物病毒檢測工作中。

2.1 國外檢測方法

國外的方法包括MFIA（多重免疫熒光）［11，12］、ELISA（酶聯免疫吸附試驗）、IFA（間接免疫熒光試驗）、HAI（血凝抑制試驗）、Enzyme（serum chemical analysis of lactate dehydrogenase，乳酸脫氫酶血液生化分析方法）或CHEM（biochemical，生物化學方法）、WB（雜交免疫印跡試驗）、PCR（聚合酶鏈反應）等方法。初次檢測選多選用MFIA或ELISA，復檢多選用IFA、HAI和PCR等方法［13，14］。

2.2 國內檢測方法

國內的方法包括ELISA、IFA、IEA（免疫酶染色實驗）、HAI、PCR等方法。其中初次檢測選多選用ELISA和IEA，復檢多選用IFA和HAI等方法。

2.3 新方法的應用

環介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術在病原微生物檢測方面已有廣泛應用［15］。日本專家Fukuda等利用ALMP原理設計RT-ALMP成功檢測了不同亞型的諾瓦克病毒［16］。基因芯片技術使得同時對成千上萬的基因的檢測成為可能。我國軍事醫學科學院軍事獸醫研究所已建立了麻疹病毒屬病毒檢測基因芯片檢測方法，其特異性強，敏感性是PCR方法的100倍。

3 實驗動物病毒學質量檢測工作中發現的若干問題

3.1 為使我國實驗動物標準盡快與國際接軌，現有檢測標準應拓展更多項目

Taconic Laboratory與Charles River Laboratories對大鼠、小鼠病毒檢測內容均達24種之多；日本筑波靈長類動物研究中心SPF食蟹猴檢測病毒9種；歐洲小型豬病毒檢測10種。我國微生物學、寄生蟲學等級標準中對大鼠、小鼠病毒檢測內容僅為15種；猴病毒檢測5種；小型豬病毒檢測9種。

Charles River Laboratories針對小鼠、大鼠都有LCMV病毒檢測要求，而國內未將該檢測項目列在大鼠病毒檢測項目中。國內有文獻報道在普通環境飼養的大鼠有LCMV抗體的檢出［17］。鼠諾沃克病毒（MNV）也是人獸共患病病原，國外應用血清學方法檢測，小鼠對該病毒有較高的感染率（北美32.64％、歐洲24.03％），我國也未將該病毒列入實驗動物質量標準予以控制，這一情況應引起我們注意，并盡快建立監測方法，對我國實驗動物MNV感染情況進行調查［18］。小鼠微小病毒（MPV）在北美及歐洲也有1.65％～3.64％的檢出率，我國也未將其列入常規檢測范圍。

日本筑波靈長類動物研究中心針對SPF食蟹猴的病毒學檢測內容達9種之多。從表2中可以看出，盡管FELASA對恒河猴的病毒學檢測內容僅有6種，未列出的是FELASA針對不同種類非人靈長類實驗動物有不同的病毒學質量標準。而我國沒有針對不同種類非人靈長類實驗動物的病毒學標準。

從表3中可以看到，FELASA與我國制定的實驗用小型豬地方（北京、上海）標準在病毒學標準上有較大差異。我國應參照標準化程度較高的國際標準，盡快建立適合我國國情以及能與國際接軌的國家標準。

3.2 應逐步將實驗動物新資源納入實驗動物病毒學質量檢測體系中

近年來實驗動物資源的開發得到較快的發展，為實驗動物新品種、品系的建立提供了有利條件，例如東方田鼠在抗血吸蟲方面、雪貂在流感病毒研究方面、土撥鼠在鼠疫研究方面都顯出良好的勢頭。研究由野生動物馴化培育的實驗動物所攜帶的病毒以及這些病毒對其自身、其他動物和人的致病性，研究制定相關的病毒學標準和監測體系，并依據標準進行監測與評價，是實驗動物化的前提。已有的實驗動物質量標準和檢測體系不能完全適應實驗動物新資源開發利用的需求，質量標準滯后和檢測手段不完善已成為制約實驗動物新資源開發、標準化研究與推廣利用的瓶頸，建立和制定新資源的質量標準和檢測體系，是今后一段時期內的研究重點［6］。盡快制定相關質量標準、建立相應的質量檢測技術、促進新資源的標準化是目前急需解決的問題［1］。

3.3 檢測試劑的標準化及檢測結果的質量控制

我國實驗動物病毒診斷試劑及檢測方法尚未達到標準化要求，某些檢測項目的檢測方法尚未建立，直接影響檢測工作質量以及檢測工作的發展。尤其是病毒檢測試劑制備所使用的毒株來源復雜，在一定程度上制約了檢測試劑的標準化。以致由多個檢測實驗室制備的診斷試劑的質量存在差異，影響了檢測工作進一步發展［10］。

為促進檢測試劑的標準化，應在引進實驗動物國際標準毒株及找到國內病毒流行株的基礎上，借鑒發達國家檢測試劑標準化的成功經驗，盡快建立和完善我國實驗動物病毒學檢測標準化體系。參照醫學臨床實驗室質量管理體系，結合實驗動物質量檢測特點，由國家級檢測實驗室發放統一的質控用標準品，開展實驗室間的質量評價，提高我國實驗動物質量檢測結果的可比性。

3.4 檢測方法的選擇缺乏多樣性

選擇合適的檢測方法是保證實驗動物質量評價的科學性和檢測結果準確性的基礎。病毒感染動物機體后，疾病病程具有明顯的規律性，一般分為潛伏期、前驅期、臨床明顯期和轉歸期。因此，對病毒性疾病的診斷要根據疾病的不同階段選用適當的檢測技術。常規的實驗動物病毒檢測方法包括病原學診斷（例如病毒分離）、血清學檢測（例如抗體檢測）、變態反應診斷（例如結核菌素實驗）和病理組織學診斷等。在實際工作中，通常僅采用血清學方法對動物進行健康檢測，然而對于處于疾病感染初期的動物或免疫缺陷動物來說，檢測結果則不能真實反映疾病感染的真實情況。只有采用幾種方法聯合應用，取長補短，才能提高檢測結果的準確性和可靠性。

3.5 質量檢測頻率缺乏靈活性

CharlesRiver實驗室、Taconic則根據病原特性不同進行監測。有的病毒2～4周檢測一次，有的每個季度檢測一次，有的則半年或一年檢測一次［13，14］。相比之下，我國實驗動物病毒檢測針對性不強，檢測頻次相對較少［19］。在根據不同病原的特性及時有效的掌握動物群中疾病的流行情況，及時診斷、發現并控制疾病的傳播方面存在欠缺。因此，根據本地的感染譜、病原特性和檢測方法的敏感性，調整監測計劃，有目的的增加檢測頻率，既保證動物質量，又可節省經費，使檢測工作在確保實驗動物質量方面起到應有的作用［6］。

3.6 哨兵動物的正確使用

由于哨兵動物的成本低，在動物疫病監測中使用方便，操作性強，被發達國家普遍采用［20］。隨著實驗動物科學的發展，我國實驗動物生產單位為加強對自由動物飼養環境設施和動物質量的自查，也已經把哨兵動物的使用作為自覺行為。然而，在哨兵動物的選擇和使用方式上卻存在一些問題（例如：哨兵動物種類、品系及大小的選擇，在生產單位放置位置的選擇以及飼養方式等［21］）。使哨兵動物不能真實反映特定環境中傳染因子的存在狀況，往往問題被發現時后果已經非常嚴重，造成了很大的經濟損失［22］。

總之，加強質量檢測，是保證實驗動物標準化的重要舉措，病毒學檢測是實驗動物質量控制的一項重要內容。隨著中國對外交往日益增加，實驗動物微生物學質量評價標準和檢測方法必須盡快與國際取得一致，否則不僅會嚴重影響我國生物醫學研究等領域與國際的交流，也將對實驗動物產業化、動物進出口帶來不利影響。

由此，為更好的適應實驗動物產業的發展，為遵循整體性、全面性、連續性原則，首先，應參照其他國家對實驗動物病毒控制要求，盡快實現與國際先進標準接軌，滿足實驗動物質量的國際化要求。其次，實驗動物病毒學監測還要根據我國國情，根據實驗動物種類、品系和級別的不同，并根據病原的不同以及病原的流行情況適時調整檢測計劃，增加檢測力度和檢測頻率，最大限度的應用適合的檢測手段，定期對動物的健康進行監測，完善實驗動物質量檢測檔案。另外，我國實驗動物病毒檢測試劑及檢測方法需盡快達到標準化要求，引進更為先進的實驗動物病毒檢測方法及檢測手段，建立良好的實驗動物檢測實驗室管理體系，提高檢測結果的準確性，滿足檢測需要。實驗動物病毒檢測這項工作的完善，將在保證實驗動物的健康、保證工作人員健康和生命安全、確保科研和檢定工作的準確性方面起重要作用。

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