鼠尾膠原蛋白提取、分離、純化方法的建立及鑒定

任海濤，鐘志勇，鄭佳琳，饒子亮，鄺少松，王 剛，唐小江

（廣東省醫學實驗動物中心，佛山 528248）

鼠尾膠原蛋白是膠原蛋白的一種，主要為Ⅰ型膠原蛋白［1］。Ⅰ型膠原蛋白主要存在于真皮、腱、骨、牙本質，以纖維形式形成膠原，由三股纏繞形成多肽鏈組［2］。作為一種新型生物材料，鼠尾膠原蛋白并不為眾人所知，但是其具有的諸多優勢，如低抗原性、生物可降解性、優越的生物相容性并有利于細胞貼附和遷移等特點［3］，為細胞增殖和功能分化提供了合適的微環境［4-5］，且它來源廣泛，成分單一，制備比較方便，是開發具有相關功能性生物醫療器械的好材料［6］。

目前，國內外對膠原蛋白提取、分離、純化主要有中性鹽法［7］、酸提取法［8-9］、堿提取法［6-10］、酶法［11-12］等，但中性鹽法、酸提取法、堿提取法方法均存在著提取得率低，且操作復雜，還可能破壞膠原蛋白的三維立體結構［13］。酶法應用較廣，但仍存在著純化困難的問題。迄今為止，還沒有針對鼠尾膠原蛋白進行大規模制備的相關研究的報道。

本研究的目的就是為了克服現有制備鼠尾膠原蛋白方法所存在的提取得率低、分離純化工藝復雜、沒有大規模生產方法等缺點，提供一種工藝簡單、提取得率和純度高的鼠尾膠原蛋白的制備方法。為大量獲得鼠尾膠原蛋白并進行更深層次的功效研究提供理論支持和實踐基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SD大鼠鼠尾，由廣東省醫學實驗動物中心提供［生產許可證號SCXK（粵）2008-0002；使用許可證號SYXK（粵）2008-0002］。

1.2 儀器與試劑

835-50型氨裁酸自動分析儀（日本Hitachi公司）；J26XP大型冷凍離心機（美國Beckman Coulter公司）；Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳儀（美國BIORAD公司）；130型制冰機（寧波新芝公司）； MIKRO20離心機（德國Hettich公司）；萬分之一天平（德國Sartorius公司）；RH basic 2磁力攪拌器（德國IKA公司）；SRM-CD47醫用保存柜（日本Sanyo公司）。

胃蛋白酶（Sigma公司）；醋酸、氯化鈉（廣州中南化工公司）、萬級透析袋（廣州威佳公司）；Tris-HCl鹽、實驗用水為18.2 mΩ超純水；其它化學試劑均為國產分析純。

1.3 實驗方法

本研究所采用的新型“酸混合酶”法通過對提取、分離、純化鼠尾膠原蛋白的單因素參數進行優化，得到了更優的擴大化生產工藝參數。首先，剝取SD大鼠尾腱需按照“從細到粗”的原則，在冰浴上進行，避免鼠尾膠原蛋白變性。同時，應將鼠尾軟骨在剝離前先自行擰成半斷裂狀，這樣可以最大限度的剝取鼠尾腱。再次，對剝離的白色鼠尾腱應立即放入含有0.05 mol/L Tris-HCl緩沖鹽的1 mol/ L NaCl溶液中處理24 h。以除去可溶性多糖、血液及其他雜質等。提取鼠尾膠原蛋白的步驟如下：1.使用溶解有一定比例胃蛋白酶的酸溶液對初步處理的鼠尾腱進行酶解，持續處理一段時間待混合物變成無色、透明、粘稠液體后即可在4℃，5000 g離心力下離心20 m in，收集上清即為粗制鼠尾膠原蛋白原液。2.將一定濃度的氯化鈉溶液加入其中，持續攪拌直至有白色絮狀沉淀從溶液中析出，繼續加入氯化鈉溶液至沉淀不在析出為止。4℃，5000 g離心力下離心20 m in后獲得白色沉淀。沉淀物加入一定濃度的酸溶液溶解。3、將溶解后的鼠尾膠原蛋白溶液繼續反復進行鹽析處理，重復步驟2的過程2～4次。持續在超純水中透析3 d，每天換液3次以除去鼠尾膠原溶液中的無機鹽類，獲得的鼠尾膠原蛋白經SDS-PAGE蛋白質電泳、氨基酸含量分析儀的鑒定，純度好。4、通過建立起來的提取方法，繼續對提取單因素進行了優化：

1.3.1 所用酸溶液的確定

不同酸溶液可以對酶解產生不同的影響，比較稀鹽酸、醋酸、檸檬酸這3種酸溶液用于提取鼠尾膠原蛋白，每種酸溶液加入用于提取的鼠尾腱1 g，其他實驗條件一致。3種酸溶液濃度均為0.05 mol/ L，持續4℃攪拌72 h。最終在0.05 mol/L濃度下的稀鹽酸、醋酸、檸檬酸提取條件下，分別獲得鼠尾膠原0.27 g、0.43 g、0.38 g。故選用醋酸溶液作為提取參數條件。

1.3.2 所用酸溶液濃度的確定

在2.2.1的優化前提下，繼續對提取所用的酸溶液濃度進行了優化，選用了0.025 mol/L、0.05 mol/L、0.10 mol/L這3個濃度。每個濃度酸溶液加入用于提取的鼠尾腱1 g，其他實驗條件一致。分別獲得鼠尾膠原0.37 g、0.44 g、0.38 g。故選用0.05 mol/L濃度作為提取參數條件。

1.3.3 所用酶溶液濃度的確定

在酸溶液中胃蛋白酶可以發揮良好的酶解效果，但綜合成本和得率考慮需要對酶溶液濃度進行探討。本研究使用1∶10000胃蛋白酶進行試驗，使用配比分別為于50 m L 0.05 mol/L醋酸溶液溶解10 mg、50 mg、100 mg、200 mg，加入用于提取的鼠尾腱1 g，其他實驗條件一致。分別獲得鼠尾膠原0.27 g、0.34 g、0.44 g、0.45 g。考慮到200 mg沒用量并沒有大幅度提供得率，故選用100 mg胃蛋白酶/50m L 0.05 mol/L醋酸溶液濃度（1∶500）作為提取參數條件。

1.3.4 所用酶作用時間的確定

時間是大規模生產上必須要考慮的一個問題，本研究優化了酶解時間，分別選用酶解36 h、48 h、72 h、96 h，其他實驗條件一致。每個提取時間加入用于提取的鼠尾腱1 g，獲得鼠尾膠原蛋白0.15 g、0.36 g、0.46 g、0.45 g。故選用酶解72 h作為提取參數條件。

1.3.5 所用氯化鈉濃度的確定

優化了分級鹽析所用的氯化鈉濃度，分別選用1 mol/L、2 mol/L、4 mol/L，其他實驗條件一致。每個提取時間配置用于提取的鼠尾腱1 g，獲得鼠尾膠原蛋白0.35 g、0.45 g、0.45 g。故選用2 mol/L作為提取參數條件。

2 結果

通過單因素條件優化，獲得的最佳提取、分離、純化條件為：0.05 mol/L的醋酸，1∶500酶用量、酶解72 h、2 mol/L氯化鈉溶液分級鹽析。提高了提取鼠尾膠原蛋白的得率，為大批量生產鼠尾膠原蛋白打下了實踐基礎，提供了理論支持。經SDS-PAGE電泳和氨基酸含量分析的鑒定，獲得的鼠尾膠原蛋白純度高。本研究簡化了提取工藝，每條大鼠鼠尾（總重）平均約5 g，可以提取到干重為200 mg的鼠尾膠原蛋白，提取得率約為4％左右。較傳統的方法提取得率僅為0.2％，提取得率提高了20倍以上。

圖1 鼠尾膠原蛋白電泳圖Fig.1 Protein electrophoresis of rat tail collagen

電泳圖中，其中1～4道為5 mg/m L濃度，1、2道為SIGMA公司產品，3、4道為自制鼠尾膠原蛋白。5、6道為20 mg/m L濃度自制鼠尾膠原蛋白，7、8道為2.5 mg/m L濃度自制鼠尾膠原蛋白。

表1 鼠尾膠原蛋白氨基酸含量分析表Tab.1 Content analysis chart of amino acid in rat tail collagen

3 討論

傳統的提取鼠尾膠原蛋白的方法主要是中性鹽法、酸提取法、堿提取法、酶法等，但是均存在著不同程度的缺點。酸提取法提取迅速，但色氨酸全部被破壞，絲氨酸和絡氨酸部分被破壞；堿提取法造成膠原肽鍵被水解，含羥基和巰基的氨基酸全部被破壞且產生消旋；中性鹽法造成肽鏈間的離子鍵會被鹽打開造成吸水膨脹，同時擴大生產的工藝不穩定；同時以上3種方法還存在著得率低的共同缺點，制約了鼠尾膠原蛋白的大規模提取。酶法反應條件溫和，能保持膠原的三股螺旋結構，但水解又不夠徹底。本研究所采用的新型“酸混合酶”法結合了酸提取法和酶法的優勢，解決了單一方法提取過程中存在的固有缺陷，同時通過對提取、分離、純化鼠尾膠原蛋白的單因素參數進行優化，使提取得率較傳統工藝提高了20倍以上。確定了工藝簡單、操作方便、提取得率高的鼠尾膠原蛋白提取、分離、純化方法。

本研究所提取的鼠尾膠原蛋白經過鑒定：（1） SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定，其制備的鼠尾膠原蛋白與現有SIMGA公司的商業化鼠尾膠原蛋白進行了對比，兩者圖譜無差異。從電泳結果上可以看出，制備的鼠尾膠原蛋白質量高，純度好。其電泳結果一致。（2）樣品經水解，經高壓液相色譜檢驗（樣品處理按GB/T 5009.124-2003水解，檢測方法按JY/T 024-1996），采用氨基酸分析儀，經廣州市分析檢測中心對本研究中制備的鼠尾膠原蛋白進行氨基酸含量分析表明，其含有①膠原蛋白特征氨基酸羥脯氨酸，含量約為8％左右；②不含胱氨酸、色氨酸這兩種氨基酸，與其自身特征相符；③甘氨酸含量接近總氨基酸含量的三分之一，與其自身特征相符。說明制備的鼠尾膠原蛋白質量高，達電泳純。為接下來鼠尾膠原蛋白的擴大化生產提供了合適的工藝參數，為大量獲得鼠尾膠原蛋白這種生物可吸收材料并進行更深層次的功效方面研究提供了理論支持和實踐基礎。

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