α-synuclein致病機制和轉(zhuǎn)基因帕金森疾病模型研究進展

張 麗，張連峰

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021）

帕金森病（Parkinson＇s disease，PD）是最常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變之一，其主要癥狀是運動功能的改變，如運動過緩、靜止震顫、步態(tài)畸形和姿勢不穩(wěn)等病變，最后導(dǎo)致運動能力喪失。流行病學(xué)調(diào)查顯示，隨著年齡增長PD患病率逐漸增高，55歲以上的人群中，帕金森病的患病率超過1％，65歲以上約為2％［1］。

PD按遺傳發(fā)病形成可分為家族性與散發(fā)性兩種，家族性PD約占PD總數(shù)的10％～15％左右，具有明顯家族遺傳傾向（顯性或隱性），而散發(fā)性PD則占PD的絕大多數(shù)，無明顯遺傳傾向，但表現(xiàn)為某種遺傳易感性。α-synuclein是一種位于突觸前末梢的蛋白，該基因的兩種錯義突變與家族性帕金森病密切相關(guān)。大量研究發(fā)現(xiàn)α-synuclein存在于許多神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的突觸末梢或細胞漿包涵體中，揭示該基因參與了神經(jīng)元的變性過程。

1 α-synuclein的表達與帕金森病

α-synuclein是一種分子量為14×103的小分子酸性可溶性蛋白。α-synuclein主要分布于神經(jīng)元突觸前末梢，尤其在腦內(nèi)新皮層、海馬、嗅球、紋狀體、背側(cè)丘腦、下丘腦、黑質(zhì)及小腦等部位的神經(jīng)元胞液中含量更加豐富［2］。PD病理特征是黑質(zhì)紋狀體多巴胺（dopamine，DA）神經(jīng)元死亡，細胞質(zhì)內(nèi)類蛋白質(zhì)物質(zhì)減少以及特征性Lewy小體（lewy body，LB）。LB內(nèi)多種蛋白質(zhì)富集，包括α-synuclein、parkin、泛素等，其中，α-synuclein蛋白是其主要成分。作為LB的重要組成部分，α-synuclein既見于散發(fā)的帕金森病患者，又見于有α-synuclein基因突變的帕金森病患者［3］。在大小鼠中，過度表達的野生型或突變型α-synuclein均能引起人類帕金森病的部分關(guān)鍵表型和病理特征［4］。

2 α-synuclein神經(jīng)元毒性機制

PD主要源于中腦黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元退行性變導(dǎo)致的細胞死亡。α-synuclein的異常表達、聚集與神經(jīng)元變性密切相關(guān)。根據(jù)目前的研究進展，可以將α-synuclein的神經(jīng)元毒性機制概括為如下4個方面。

（1）α-synuclein寡聚體和路易小體

在α-synuclein蛋白纖維化的過程中，存在αsynuclein寡聚體、寡聚體中間構(gòu)象——初原纖維（protofibrils）和最終的淀粉樣纖維包涵體（fibrillar inclusions）等不同聚集狀態(tài)［5-6］。首先，自然狀態(tài)下，α-synuclein呈無序的未折疊結(jié)構(gòu)的單體，但在高濃度時，它可轉(zhuǎn)變成α-synuclein寡聚體的中間構(gòu)象——初原纖維（protofibrils），與單體不同，這類寡聚體富含B片層結(jié)構(gòu)，在原子力顯微鏡及電鏡下，可以觀察到這類寡聚體的形成過程中，這類寡聚體先呈包含20～30個α-synuclein分子的圓柱狀結(jié)構(gòu)，隨后彼此聚合形成鏈條狀，最終轉(zhuǎn)化可溶性纖維多聚體。最后，借助于微管轉(zhuǎn)運，細胞有時能將這些小球狀的聚集物形成更大的包涵體，其中包含了纖維狀的a-synuclein及其他幾種蛋白質(zhì)。其中寡聚體毒性機制可能是通過整合于細胞膜引起胞膜的瞬時通透性增加及膜內(nèi)包含物的外滲［7-8］，初原纖維多聚體的出現(xiàn)則與破碎的高爾基器相關(guān)，是細胞變性的早期特征［9-10］，而包涵體（如路易小體）的形成可能是細胞自我保護的一種方式。

（2）線粒體功能障礙

線粒體功能障礙（主要是呼吸鏈功能異常）導(dǎo)致ATP合成衰竭也可出現(xiàn)帕金森病的臨床表現(xiàn)，使用相應(yīng)的藥物可使早期帕金森病患者的癥狀緩解。因此，線粒體功能障礙是PD研究中解釋神經(jīng)元損傷一個重要機制。研究發(fā)現(xiàn)，α-synuclein基因過度高表達促進GT1-7細胞內(nèi)線粒體形態(tài)改變，如線粒體腫脹、嵴空泡化［11］，在PC12細胞中引起線粒體去極化和誘發(fā)線粒體依賴的細胞死亡［12］，而且，表達α-synuclein的細胞對于蛋白復(fù)合體I抑制劑魚藤酮更加敏感［13］。現(xiàn)已證實，α-synuclein可與線粒體呼吸系統(tǒng)的關(guān)鍵酶細胞色素C氧化酶（COX）特異結(jié)合［14］。但是胞漿里的α-synuclein如何接觸、作用于線粒體內(nèi)膜的機制尚有待闡明。

（3）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體應(yīng)激

α-synuclein過表達引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體囊泡運輸障礙，進而干擾細胞或者神經(jīng)元的正常功能［15］。在瞬時高表達α-synuclein的COS7細胞中觀察到高爾基體碎片［9］，這可能是αsynuclein異常積聚導(dǎo)致的結(jié)果。PC12細胞中過表達α-synuclein，導(dǎo)致GRP 78和磷酸化的起始因子2α（eIF-2α）等兩種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標記物表達上調(diào)，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑salubrinal能夠一定程度上防止細胞死亡［16］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生在α-synuclein誘導(dǎo)表達后的4～8 h之后和細胞死亡之前。在α-synuclein過表達果蠅模型上，通過增加囊泡運輸調(diào)節(jié)蛋白Rab1的表達水平，能夠一定程度上減少α-synuclein誘導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)元丟失［15］。值得警惕的是，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體應(yīng)激并不能完全逆轉(zhuǎn)多巴胺神經(jīng)元丟失，這表明在更復(fù)雜的系統(tǒng)中可能存在多種機制。然而，這些因素都還不能精確的解釋α-synuclein如何影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的，也不能真正解釋DA神經(jīng)元群在PD中的選擇性損傷。

（4）氧化應(yīng)激

多巴胺能神經(jīng)元損傷是PD的主要病理特征，異常的a-synuclein聚集會破壞多巴胺的自身平衡，并增加黑質(zhì)神經(jīng)元的氧化應(yīng)激。多巴胺在多巴胺能神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)合成后立即被轉(zhuǎn)運到單胺能囊泡中儲存，如果未被儲存，多巴胺能夠自氧化生成有毒性的多巴胺醌類物質(zhì)，伴隨超氧化基和過氧化氫產(chǎn)生［17-18］。在多巴胺能神經(jīng)元中，變異a-synuclein導(dǎo)致囊泡數(shù)量減少，胞質(zhì)內(nèi)多巴胺濃度升高，使多巴胺依賴的氧化應(yīng)激增強。在SH-SY5Y細胞內(nèi)過度表達野生型和突變型的a-synuclein都會導(dǎo)致細胞內(nèi)ROS水平升高，在多巴胺存在下，細胞存活數(shù)量大大減少，尤其是表達突變型的細胞［19］。因此，asynuclein聚集和多巴胺引起的氧化應(yīng)激可能是PD發(fā)病機制的重要環(huán)節(jié)。

4 α-synuclein帕金森動物模型

為了闡明α-synuclein在PD中的可能作用機制，人們開始嘗試建立各種動物模型包括轉(zhuǎn)基因模型和病毒載體注射等其它模型。這些轉(zhuǎn)基因模型不同程度模擬了PD患者的病理表型，如αsynuclein蛋白的聚集和病理性沉積，轉(zhuǎn)基因動物表現(xiàn)出運動協(xié)調(diào)能力喪失等，表一對不同啟動子調(diào)控表達的α-synuclein轉(zhuǎn)基因動物模型的表型進行了比較。

表1 α-synuclein轉(zhuǎn)基因大鼠、小鼠模型的關(guān)鍵表型比較Tab.1 Comparison of key phenotypes ofα-synuclein transgenic mice and ratmodels

（1）PDGF-βαSNCAWT轉(zhuǎn)基因小鼠模型

Masliah等［4］制作和分析了人類野生型αsynuclein轉(zhuǎn)基因小鼠。轉(zhuǎn)基因小鼠可檢測到胞漿及核內(nèi)的有電子致密包涵體，DA能神經(jīng)元減少、紋狀體內(nèi)酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）活性減低及運動行為障礙等。與人類PD不同的是，黑質(zhì)內(nèi)DA能神經(jīng)元無變性缺失。

（2）PDGF-αSNCAA53T轉(zhuǎn)基因小鼠模型

高寧等［20］建立了A53T突變型α-synuclein轉(zhuǎn)基因小鼠，免疫組化顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠大腦海馬、新皮層、紋狀體區(qū)出現(xiàn)人α-synuclein陽性標記的細胞。轉(zhuǎn)棒實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠存在明顯的進行性運動能力障礙。

（3）PrP-αSNCAA30P轉(zhuǎn)基因小鼠模型

αSNCAA30P轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出進行性運動能力障礙，如僵直、步態(tài)畸形和靜止震顫等。病理學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)進行性神經(jīng)膠質(zhì)增生，未發(fā)現(xiàn)LB樣α-synuclein包涵體，黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元系統(tǒng)無退行變性［21］。

（3）Thy1-αSNCAA53T和Thy1-αSNCAWT轉(zhuǎn)基因小鼠模型

Putten等［22］制作了α-synuclein野生型和A53T突變型小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種轉(zhuǎn)基因鼠的神經(jīng)系統(tǒng)均出現(xiàn)了與PD病人相似的α-synuclein病理學(xué)改變。

（4）Thy1-αSNCAA30P和Thy1-αSNCAWT轉(zhuǎn)基因小鼠模型

Kahle等［23］也通過建立轉(zhuǎn)基因鼠研究野生型和A30P突變型α-synuclein的亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)兩種類型的α-synuclein在兩種轉(zhuǎn)基因鼠的神經(jīng)元和軸突中都有異常聚集。

（5）α-Synuclein細菌人工染色體轉(zhuǎn)基因小鼠（α-synuclein BAC）

Yamakado H等［24］建立人α-synuclein BAC轉(zhuǎn)基因小鼠，該轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出焦慮樣行為（可能反映PD早期的非運動癥狀）減少，下降的SERT表達水平可能提示其內(nèi)在分子機制。因此，α-synuclein BAC轉(zhuǎn)基因小鼠可以作為評價α-synuclein劑量效應(yīng)的工具，具有重要研究價值。

（6）四環(huán)素誘導(dǎo)型SNCAA53T轉(zhuǎn)基因小鼠（tetOSNCAA53T）

Lin X等［25］成功建立了tetO-SNCAA53T轉(zhuǎn)基因小鼠。與野生型小鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠呈現(xiàn)嚴重的運動障礙和中腦多巴胺能（mDA）神經(jīng)元變性，模擬了PD關(guān)鍵的運動表型和病理表型。而且，mDA神經(jīng)元也有明顯的亞細胞改變，如多巴胺釋放減少，高爾基體碎片，自噬體溶酶體系統(tǒng)損傷。此模型適用于PD的發(fā)病機制研究和α-synuclein蛋白積聚引發(fā)的神經(jīng)損傷。

（7）α-synuclein轉(zhuǎn)基因大鼠帕金森模型（Thy-A30P-A53T）

F.Lelan等［26］建立了Thy-A30P-A53T轉(zhuǎn)基因SD大鼠，轉(zhuǎn)基因大鼠雖然不存在運動障礙，但呈現(xiàn)出嗅覺障礙的PD早期非運動表型。人α-synuclein蛋白共定位于TH陽性的嗅球（OB）神經(jīng)元上，而前腦腦室下區(qū)SVZ區(qū)則不表達。Thy-A30P-A53T轉(zhuǎn)基因大鼠可以作為研究人突變的α-synuclein對于嗅覺障礙的發(fā)展機制的有用工具。

（8）重組腺伴隨病毒介導(dǎo)α-synuclein過表達大鼠帕金森模型（rAAV-CBA-α-synuclein）

大鼠黒質(zhì)紋狀體注射rAAV-CBA-α-synuclein載體，α-synuclein野生型和突變型手術(shù)大鼠均表現(xiàn)出30～80％黒質(zhì)多巴胺神經(jīng)元丟失，紋狀體內(nèi)多巴胺水平下降40～50％。多巴胺神經(jīng)元丟失50～60％以上的大鼠還表現(xiàn)出嚴重的運動功能障礙［27］。因此，rAAV-CBA-α-synuclein大鼠可以作為一種PD模型，它成功復(fù)制了人PD的主要病理特征、神經(jīng)生化特征和行為學(xué)特征。

綜上所述，大量研究工作揭示α-synuclein與神經(jīng)元變性相關(guān)。首先，α-synuclein蛋白聚集，形成具有疏水性的寡聚體，表現(xiàn)出較強的細胞毒性。其次事件還包括ER內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激等。最后，以上事件激發(fā)的細胞死亡。這些結(jié)論都依賴于α-synuclein相關(guān)動物模型的發(fā)展［28-29］。這些動物模型驚人地重現(xiàn)了PD疾病的早期特征。因此，應(yīng)合理地將其應(yīng)用到PD發(fā)病機制研究及其藥物治療研究等領(lǐng)域，為PD的研究提供重要手段。

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