沙棘黃酮提取進展

彭 游，湯 明，胡小銘，鄧澤元2

1九江學院應用化學研究所，九江332005;2南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，南昌330047

沙棘黃酮提取進展

彭 游1，2*，湯 明1，胡小銘1，鄧澤元21

1九江學院應用化學研究所，九江332005;2南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，南昌330047

沙棘黃酮是食藥兩用植物沙棘主要的保健與藥用成分，具有重要的生理活性，能夠清除體內的自由基，防治心血管疾病和抗衰老的作用。本文概述了國內外對沙棘資源的開發利用研究狀況，綜述了沙棘黃酮類化合物提取方法的最新研究進展，為充分利用沙棘資源和開發沙棘黃酮提供科學研究基礎。

沙棘;黃酮類化合物;提取

Abstract:Seabuckthorn flavonoids are a major healthcare and pharmaceutical ingredients of seabuckthorn.They have important physiological activities that can remove free radicals，treat cardiovascular disease，and be anti-aging.To provide scientific basis for utilizing of sea-buckthorn resources and exploration of seabuckthorn flavonoids，an overview of sea buckthorn flavonoids extraction of the latest research advances was completed in this paper.

Key words:seabuckthorn;ketone category compound;extraction

沙棘(Hippophae rhamnoides Linn)是胡頹子科(Elaeagnaceae)多年生落葉喬木或灌木，能防風固沙、保持水分和改良土壤，具有優良的生態效益。沙棘的果實被譽為第三代水果，營養價值高，藥用價值也被廣泛認同。20世紀90年代以來，國內外對沙棘進行了大規模的開發利用和較深層次的研究［1-3］。

從20世紀50年代到80年代，前蘇聯有9項沙棘研究成果獲得國家專利，其中藥用油已廣泛投入醫用。1995年日本從沙棘油中精制提取出了最新的抗癌針劑藥物。近年來，我國對沙棘的藥用研究比較活躍，相繼研究報道了沙棘提取物在抗癌治癌方面的功效以及對心腦血管疾病、燒傷等的治療作用［4］。如今，沙棘已被視為寶貴的藥用植物，隨著對沙棘資源開發和研究的深入，人們發現在沙棘果肉中所含的沙棘黃酮在治療和緩解人類的某些疾病，如抗心肌缺血，抑制動脈粥樣硬化，降低血中膽固醇，抗心律失常等方面具有明顯的療效［4-7］。本文主要對沙棘中黃酮類化合物的提取方法進行綜述。

1 溶劑提取法

對于沙棘黃酮類化合物利用水、醇等傳統溶劑的提取方法，國內外做了充分研究，但每年仍有不少相關報道［8-26］，主要分為沙棘總黃酮與花青素的提取?，F僅對沙棘黃酮類化合物的傳統溶劑提取法進行簡要綜述。

劉錫建［8，9］等人采用正交實驗法確定了沙棘果渣總黃酮提取的最佳條件:石油醚脫脂，65%的乙醇溶液作提取劑，溫度80℃，提取3次(1 h/次)，料液比為1∶8(W/V)，沙棘果渣提取總黃酮得率高達5.344 mg/g。實驗結果還表明X-5樹脂可以很好的精制沙棘總黃酮。通過5倍體積總黃酮溶液時，吸附率為96.2%，再用3倍體積75%的乙醇基本能把吸附在X-5樹脂上的沙棘總黃酮洗脫下來，洗脫率為96.5%，產品真空干燥后純度達到23.0%(市場要求不低于20%)。提取和精制工藝流程為:沙棘果渣→石油醚脫脂→干燥→乙醇提取→提取液→回收乙醇→醇沉→離心→回收乙醇→黃酮水溶液→X-5樹脂吸附→75%乙醇洗脫→洗脫液→回收乙醇→干燥→黃酮產品。

阮棟梁［10］等人利用硅膠柱和葡聚糖凝膠柱層析，結合1H NMR與13C NMR等結構鑒定手段，從沙棘葉中分離得到芹菜素(Ⅰ)與山柰酚(Ⅱ)。分離純化路線為:沙棘葉→石油醚脫脂→甲醇提取→回收甲醇→濃縮液→正己烷萃取→母液→濃縮→干燥→黃酮粗品→硅膠柱層析→葡聚糖凝膠柱層析→乙醇重結晶→結構鑒定→化合物Ⅰ和Ⅱ。芹菜素在沙棘黃酮中含量較高。由于沙棘黃酮為一類多羥基化合物，大多容易吸附在硅膠柱上，難以洗脫，所以最終僅有芹菜素與山柰酚被分離純化。

王振宇［11］等人采用溶劑法提取大果沙棘總黃酮，并在單因素試驗基礎上，利用響應面分析法考察乙醇的體積分數、提取的溫度、液固比和提取時間對總黃酮得率的影響，并對提取工藝進行優化。最佳提取條件:提取溫度 61.85℃，乙醇體積分數71.36%，提取時間為 2.59 h，液固比(V/m)為18.33 mL:1 g，此條件下黃酮得率為0.741%。經響應面設計法優化后，可以找到各因素的最佳值并獲得較理想的得率;同時，各個因素間的相互作用對生產過程中工藝參數的設置提供了參考。

陳雛［12］等人采用乙醇滲漉從沙棘果實中提取總浸膏，經不同溶劑萃取，硅膠、聚酰胺低壓柱層析等方法分離并進行結構鑒定。分離鑒定出的化合物為:異鼠李素、槲皮素、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷和蘆丁等成分。其中異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷為首次從中國沙棘果實中分離得到的黃酮化合物。

徐曉云［13］等人以脫脂沙棘籽為原料，乙醇為提取液，通過提取溫度、提取時間、脫脂時間、料液比、酒精濃度和pH值6個單因素實驗，在中心組合實驗基礎上，采用響應面分析法，確定沙棘籽中原花色素的最優提取條件。在提取溫度21℃、pH 5.1以及酒精濃度65%時，沙棘籽中原花色素的提取率達5.84%(以脫脂沙棘干重計)，粗品純度達39.18%。

邸多?。?0］等人以浸膏得率和總黃酮含量為評價指標，利用L9(34)正交試驗優選出沙棘葉總黃酮水提工藝最佳條件為8倍量水(w/v)回流提取2次，每次2.0 h;醇沉工藝最佳條件為:提取藥液濃縮至相當于原生藥1.0 g/mL，緩慢加入6倍量(w/v)80%乙醇溶液。此提取工藝可為新藥研究和工業化制劑生產提供參考。李辰［21］等人利用類似水提醇沉法提取沙棘葉黃酮，還考察了5種大孔吸附樹脂(HPD600、YWD01G3、YWD01F、07C 和 AB-8)對沙棘葉黃酮苷元的靜態吸附/解吸附性能。實驗結果表明:非極性樹脂YWD01G3在吸附/解吸附方面顯示出最佳的綜合性能，對槲皮素、山奈酚、異鼠李素的平均吸附率和解吸附率分別為90.81%和59.51%。該實驗為初步確定沙棘葉黃酮純化用大孔樹脂和進一步研究其動態吸附/解吸附提供了依據。

從以上文獻可知，傳統溶劑提取法中前處理主要采用石油醚脫脂，提取溶劑有水、甲醇水溶液等，但大多采用乙醇水溶液提取黃酮類物質。乙醇的濃度在50% ～80%之間，在提取中考慮pH是必要的，堿性條件更利于低分子量黃酮的溶解，純化一般采用大孔吸附樹脂等。傳統溶劑提取法同其它比如微波萃取，超聲輔助提取等方法相比，一般具有操作及設備簡單，成本低，見效快，易于工業化等優點，但存在資源消耗大等不足。

2 分子烙印技術輔助提取法

共價分子烙印技術基本原理是:在含有大量交聯劑的溶液體系中，模板分子(TMP)和功能單體以非共價作用(如氫鍵作用、離子對相互作用等)形成主客體配合物，通過引發功能單體和交聯劑的聚合反應，形成高度交聯高分子剛性骨架，得到分子烙印聚合物(MIP);當以一定方式消除功能單體和模板分子間的作用，在模板分子從MIP中流出的同時，留下了和模板分子構型類似的孔穴和相應的可作用位點。因此，MIP將對TMP及和TMP具有類似結構和官能團的物質呈現出預期的選擇性和高度的識別功能［27-29］。

周力［27］等人制備了以槲皮素為模板的MIP，從沙棘粗提物中分離槲皮素和異鼠李素，取得良好效果。表明以槲皮素為模板的MIP可有效地從沙棘粗提物中分離槲皮素和異鼠李素，同時也預示著分子烙印技術在中藥有效成分提取中所具有的良好前景。提取分離流程為:MIP的合成→干燥→反復洗滌→干燥→槲皮素MIP→裝柱(用于分離沙棘黃酮);沙棘粗提物酸水解→旋干→甲醇定容→沙棘水解物溶液→加載于分離柱→甲醇洗脫→甲醇-醋酸洗脫→HPLC檢測。

中藥成分的多樣性導致其有效成分的提取過程十分繁瑣，應用分子烙印聚合物的這種特異親合性，針對某一類成分進行直接提取，簡化步驟，但該技術可行的前提條件是中藥功效成分能和合適的功能單體形成如氫鍵、離子對等分子間作用，這也體現了分子烙印技術應用中存在的局限性。

3 超臨界流體萃取法

廖周坤［30］等人應用超臨界CO2萃取技術對從去脂后的沙棘果渣中提取總黃酮(以異鼠李素計)的工藝進行研究，用均勻設計法優化出最佳工藝。實驗表明，利用超臨界CO2萃取技術(CO2-SFE)所得的總黃酮的提取率為傳統溶劑提取工藝提取率的1.245倍。夾帶劑中乙醇濃度增加時，其提取率也隨之增加，但當用95%乙醇作夾帶劑時，其提取率反而下降，可以看到，異鼠李素的提取率與夾帶劑濃度呈拋物線狀關系。加入一定極性夾帶劑后，CO2-SFE有較高提取率，在于混入該夾帶劑的超臨界CO2流體在藥材中的擴散速度、擴散深度及其與被提取物質分子間的作用力與傳統溶劑萃取法相比有明顯改善。并且在加夾帶劑的CO2-SFE中，夾帶劑的極性可靈活選擇，以適應于各種極性溶質的提取。

CO2-SFE是一種可以在較低溫度條件下進行有效成分的提取方法，有利于保護有效成分免于破壞，但用這種方法一步完成植物藥的單體分離，一般是不可能的，事實上也沒有哪種方法能做到。目前對粗提物用制備色譜或HSCCC，結合重結晶反復純化才可能得到純品。然而CO2-SFE卻有可能創造出一般溶劑萃取達不到的條件，大幅度改善有效成分的提取率和最終收率，特別是對貴重藥材的有效成分的提取上，很有工業開發價值。

4 超聲波輔助提取法

祖元剛［31］等人以沙棘葉為原料，通過正交實驗優化了沙棘總黃酮的超聲波提取工藝，考察了超聲波作用時間、超聲溫度、液料比和提取次數4個因素對沙棘葉總黃酮提取率的影響。確立的工藝條件為:提取溶劑85%乙醇，液料比25/1(mL/g)，超聲波溫度46℃，作用時間25 min，提取1次。結果表明，超聲波提取沙棘總黃酮的提取率為1.72%，與索氏提取的提取率相當，但超聲波提取具有時間短，提取溶劑用量少的明顯的優勢。通過逐步回歸對沙棘總黃酮超聲波提取的過程進行了數學模擬，其回歸方程能較好地模擬實際提取過程，可以對未知提取過程進行預測［32］。

馬養民［33］等人利用超聲技術從棘果渣中分離出異鼠李素和槲皮素兩個黃酮類化合物，實現了沙棘廢料的有效利用。提取最佳工藝參數:提取液乙酸乙酯與95%乙醇之比為3∶7(V/V)，料液比為1∶10(W/V)，在溫度50℃條件下超聲30 min。提取的總黃酮經二次硅膠柱梯度洗脫，一次葡聚糖凝膠柱層析以及多次重結晶得到純品，經UV、1H NMR以及IR進行分析鑒定為異鼠李素和槲皮素，異鼠李素得率為0.55%。由于該法在純化過程中采用了硅膠柱層析，具有5個羥基的槲皮素更容易被吸附在載體上，難以洗脫下來，因此收率不如異鼠李素高。該分離純化法較適宜沙棘中異鼠李素的分離。

焦翔等［34］以中國青海產中國沙棘葉和內蒙古產大果沙棘葉為原料，分別選擇水與乙醇作提取溶劑，以超聲波輔助浸提提取。采用紫外-可見光分光光度法測定了提取物的總黃酮含量，采用管碟法和試管兩倍稀釋法測定提取物對13種常見食品污染微生物的抑制效果。結果表明，青海產中國沙棘葉提取物的總黃酮含量和提取物抑菌活性均優于內蒙古產大果沙棘葉;乙醇提取物總黃酮含量和抑菌效果均顯著優于水提取，作者認為超聲輔助提取有助于保持提取物的抑菌活性。

姜少娟等［35］采用超聲波提取法從沙棘果渣中提取總黃酮，以正交試驗法確定了總黃酮的最佳提取工藝，并與傳統溶劑回流提取法進行了比較。超聲提取沙棘果渣總黃酮的最佳提取工藝為，提取液為3/7(乙酸乙酯/體積分數95%乙醇，V/V)，料液比(W/V)為1/10，在溫度50℃下提取30 min。提取方法的比較結果表明，超聲提取法優于傳統回流提取法，超聲提取法大大節省了提取所需的時間，降低了生產成本，提高了經濟效益，為開發利用沙棘果渣提供了有益的參考。

楊喜花等［36］研究了超聲循環技術在沙棘葉總黃酮提取中的應用。對乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮等不同提取溶劑的提取效果進行比較得出乙醇是超聲提取沙棘葉總黃酮的最佳溶劑。采用索氏、超聲與超聲循環方法提取總黃酮的實驗表明，超聲循環提取法可提高沙棘葉中總黃酮的提取效率，超聲循環提取10 min已經達到了索氏提取6 h的效果。作者認為，75%乙醇用于不同提取方法提取沙棘葉總黃酮，均為溶劑的最佳體積分數。超聲循環提取的效果明顯優于普通超聲提取與索氏提取。超聲提取與索氏提取相比，節約了時間和能耗，且提取工作在室溫下進行，可避免高溫對提取成分的影響。

超聲波技術在天然產物提取中已顯示出巨大的優勢，原理是利用超聲波產生的強烈振動、空化效應、攪拌作用等可以加速植物有效成分進入溶劑，提高提取效率，縮短提取時間，簡化操作步驟。但值得注意的是，對于超聲乙醇提取這個方法，仍需加大研究，本著節省能源、溶劑和時間，簡化操作與盡量多保留與提取天然活性成分的原則，求得最優提取條件。

5 微波/光波提取法

微波提取技術是天然產物提取中一種非常有發展潛力的新型技術。微波是一種頻率在300 MHz～300 GHz之間的電磁波，具有波動性、高頻性、熱特性和非熱特性四大基本特性。微波加熱是靠穿透物質，使物體內部分子產生震動和摩擦，從而對物體加熱，是由內向外的加熱。在快速振動的微波電磁場中，被輻射的極性物質分子吸收電磁能，以每秒數十億次的高速振動產生熱能［37，38］。自 Ganglier等［39］最早利用微波萃取法從羽扇豆中提取鷹爪豆生物堿后，該技術成為天然產物提取的有力工具。

本課題組利用微波光波組合法提取茶皂素與沙棘果渣中的黃酮獲得成功［40，41］。建立了用于輔助提取沙棘果渣黃酮的微波光波組合法，并初步闡述了微波提取黃酮的機理。研究表明，原料粉碎至0.022～0.056 mm，加入9.4%的 DMF 調勻，通過微波光波組合方式加熱，功率為800 W(微波55%與光波45%)，加熱8 min后，用200 mL乙醇分兩次萃取總黃酮，純化后提取率與常規方法提取相當。利用高倍熒光顯微鏡FM、IR等手段對微波提取機理進行初步研究，從微波對植物組織結構的影響上闡明次生代謝產物的微波提取機理。次生代謝產物如黃酮在植物細胞液泡中，微波輻照下，極性的黃酮分子高速旋轉，破壞了黃酮分子與周圍分子的分子間力平衡。液泡中介質沸騰沖破液泡，同時木質素細胞壁中的強極性分子糖類同樣在微波下高速旋轉，而破裂，從而有利于黃酮分子與組織的分離。

楊喜花等［42］研究微波技術在沙棘葉總黃酮提取中的應用，并為產業化生產提供試驗性指導。采用單因素試驗和正交試驗考察不同因素對微波提取沙棘葉總黃酮的影響，優選提取工藝。最佳條件為微波輻照10 min，微波功率400 W，乙醇體積分數為75%，料液比1∶25(W/V)。研究表明，微波提取技術應用于沙棘葉總黃酮的提取，具有省時、高效、節能等優點。

趙二勞等［43］研究了表面活性劑增效微波提取沙棘葉黃酮工藝，篩選出了具有明顯增溶效果的表面活性劑—椰子油脂肪酸二乙醇酰胺。實驗確定的較佳提取工藝條件:以質量分數0.9%的椰子油脂肪酸二乙醇酰胺水溶液為提取劑，微波功率540 W，提取5 min，料液比為1∶40(W/V)。該工藝比僅用微波的提取率提高43.8%。表面活性劑協同微波提取沙棘葉黃酮，其提取率提高的原因可能是由于表面活性劑具有特定的雙親分子結構，可降低沙棘葉細胞膜與水溶液間的界面張力，更利于水溶液通過毛細管或細胞間隙滲透進入細胞壁內，溶解可溶的沙棘葉中黃酮，使細胞內外濃度差增大，水不斷滲透進入細胞組織，提高細胞內部系統含水量。當采用微波技術協同提取時，細胞內溶液吸收微波后在短時間內能量快速上升，細胞內部壓力提高，促使細胞膜內外兩側滲透壓增大，細胞膜快速破裂，黃酮溶液比僅用微波法時更易流出，從而提高了它的浸出效能和提取率。在該方法中表面活性劑作為提取助劑的使用有一定的科學性，但要考慮其與產品的分離問題。

陳金娥等［44］研究了微波萃取法浸提沙棘黃酮與索氏浸提法最優工藝條件。通過單因素和正交實驗法作了對比研究。索氏浸提法為溫度75℃，時間6 h，固液比1∶20(W/V);微波法為功率180 W，時間 6 min，固液比 1∶10(W/V)，pH 值為 9.1。在最優條件浸提沙棘葉中的黃酮，兩種方法的產率分別為3.697 mg/g和4.536 mg/g。微波萃取法黃酮產率高、省時、溶劑用量少、耗能低等優點。

6 酶輔助提取法

朱洪梅等［45］通過單因素和正交試驗研究了纖維素酶輔助提取沙棘葉中黃酮類化合物主要影響因素，確定最佳提取工藝。各因素影響黃酮得率順序依次為酶添加量＞酶解時間＞料液比＞酶解溫度。最佳提取工藝為:酶添加量4%，料液比1/50(W/V)，酶解溫度40℃，酶解時間2 h。工藝流程為:沙棘葉→烘干→粉碎→酶解→醇溶液浸提→取上清液→濃縮→粗產品。酶添加量對黃酮得率影響達到顯著，是提取沙棘葉黃酮的主要影響因素。纖維素酶酶解預處理與醇提法相結合的提取工藝為沙棘葉總黃酮的提取提供了一種新方法，并且獲得較好的效果。

纖維素酶可在半纖維素酶、果膠酶等的協同作用下，破壞植物的細胞壁，使細胞內容物裸露出來，可能有利于次生代謝產物黃酮等物質的溶解，因而提取率可能增加。但纖維素酶等酶的使用，也可能使植物內的活性成分分解喪失，達不到提取的目的。

7 勻漿法提取法

勻漿提取是指生物組織通過加入提取溶劑進行組織勻漿或磨漿，以提取活體組織中有效成分的一種提取方法。應用該方法對氨基酸、蛋白質和萜類物質進行提取的研究都有報道［46，47］，但將此方法應用到黃酮類成分提取方面的研究尚少見。應用勻漿法提取生物活性成分，可以直接將鮮物料置于勻漿機內，加入溶劑直接提取，此方法不但縮短了提取時間，而且省去了對物料進行烘干、粉碎的步驟。

趙春建［48］等人對利用勻漿法提取沙棘果中總黃酮的工藝進行了研究，確定了最佳的工藝參數:提取原料為含水率85%的沙棘果，溶劑為85%的乙醇，勻漿時間10 min，液固比為5∶1(mL/g)。將該法與常規的回流提取法進行了比較。結果表明，在優化的條件下，勻漿法對沙棘果總黃酮的提取率為0.76% ，與回流提取相當。

將含一定量水的鮮果與提取溶劑在勻漿提取裝置中混合勻漿，通過機械及液力剪切作用將物料撕裂和粉碎，使物料破碎和有效成分的提取同步進行，以達到對植物有效成分快速、強化提取的目的。勻漿提取法較常規回流提取法具有提取率高、提取時間短、溶劑用量少、成本低的優點。勻漿提取省去了對物料進行烘干、粉碎的步驟，操作簡單，對其它新鮮植物材料中天然產物的提取具有借鑒意義。但該方法依然存在能耗高，難以后處理的缺點。

8 展望

目前沙棘總黃酮的提取方法主要有水提法、有機溶劑提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法和超臨界流體萃取法等。盡管傳統溶劑提取法具有耗時耗能，消耗大量溶劑，經濟與環境成本均很高等不足。但由于操作簡單，人員設備要求不高，目前依然在工業生產中普遍使用，但在傳統提取方法中，活性成分的純化方法，活性成分種類以及成分的化學變化等應該成為進一步研究重點。超臨界CO2萃取法提取速度快且安全性高，但目前國產的超臨界萃取設備容積偏小，無法滿足工業化生產的需要，而進口設備價格十分昂貴。微波輔助提取法選擇性高、操作時間短、溶劑消耗量少，但設備泄漏的微波輻射會給人體造成慢性損傷。超聲波輔助提取法提取效率高，提取時間短，但是超聲波作用能斷開碳—碳鍵，從而產生活性較強的自由基，破壞活性成分，降低提取物的穩定性。

綜上所述，沙棘中活性成分的提取的研究遠沒結束，提取方法要避免過高的經濟與環境成本，同時還要有利于資源的充分利用，以及產品的生物活性的保持與提高。

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Advances in Extraction of Flavonoids in Seabuckthorn

PENG You1，2*，TANG Ming1，HU Xiao-ming1，DENG Ze-yuan2

1Institute of Applied Chemistry，Jiujiang University，JiuJiang 332005，China;2Key Laboratory of Food Science of Ministry of Education，Nanchang University，Nanchang 330047

Q946.91;R284.2

A

1001-6880(2012)04-0562-07

2010-07-01 接受日期:2010-09-06

國家自然科學基金(81160412);江西省自然科學基金(2010GZN0106);江西省教育廳科技項目(GJJ11626)

*通訊作者 E-mail:trihydracid@126.com