蕨菜黃酮對(duì)染矽塵小鼠氧化應(yīng)激及肺纖維化的影響

谷仿麗，陳乃富，*，戴 軍

1皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院;2植物細(xì)胞工程安徽省工程技術(shù)研究中心，六安237012

蕨菜黃酮對(duì)染矽塵小鼠氧化應(yīng)激及肺纖維化的影響

谷仿麗1，陳乃富1，2*，戴 軍2

1皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院;2植物細(xì)胞工程安徽省工程技術(shù)研究中心，六安237012

為探討蕨菜黃酮對(duì)染矽塵小鼠的抗氧化應(yīng)激及肺纖維的影響，采用超聲霧化石英粉塵混懸液，使小鼠染塵，蕨菜黃酮(Pteridium aqulinum flavonoids，PAF)連續(xù)灌胃染塵小鼠3周，取血測(cè)血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，S0D)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)，并測(cè)肺組織中SOD、MDA、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)，計(jì)算肺質(zhì)量系數(shù)，取右肺下葉做病理組織觀察;結(jié)果顯示蕨菜黃酮組血及肺組織MDA值顯著下降、SOD活力顯著升高，肺組織GSH-Px活力顯著升高，肺Hyp含量及肺指數(shù)顯著下降，肺纖維化進(jìn)程延緩，表明蕨菜黃酮對(duì)染矽塵小鼠具有較好的抗氧化應(yīng)激效應(yīng)，延緩了肺纖維化進(jìn)程。

蕨菜黃酮;矽塵;小鼠;氧化應(yīng)激;肺纖維化

二氧化硅(SiO2)能使肺泡巨噬細(xì)胞生物膜的類脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)并產(chǎn)生自由基，脂質(zhì)過氧化改變也影響成纖維細(xì)胞，使其功能活化，釋放過量膠原蛋白、彈性蛋白和蛋白多糖，最后形成彌漫性肺膠原纖維化，促進(jìn)矽肺的發(fā)展［1］。

蕨菜具有清熱滑腸，降氣化痰，利水安神等功效;本課題組的前期研究表明，蕨菜含有較高黃酮類物質(zhì)，蕨菜黃酮具有良好的抗氧化作用［2］。因此，本實(shí)驗(yàn)擬以蕨菜黃酮灌胃矽塵染毒小鼠，觀察其對(duì)染矽塵小鼠氧化應(yīng)激及肺纖維化的影響，來探討蕨菜黃酮是否具有防治矽肺的功能，為蕨菜黃酮進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種健康小鼠，雄性，體重20±2 g，南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證：SCXK(蘇) 2002—0031。在本實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。

1.2 試劑與藥品

蕨菜，采自大別山區(qū)，103℃烘箱干燥，粉碎過40目篩，備用;

石英粉塵：粒徑＜5 μm占99.5%，游離的SiO2為97%，由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病研究所塵肺研究室提供的標(biāo)準(zhǔn)石英粉塵;

谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、羥脯氨酸(Hyp)檢測(cè)試劑盒，均由南京建成生物工程研究所提供;

乙醇，三氯乙酸、二甲苯等，由上海競(jìng)鳴化工科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 儀器

402AI型超聲霧化器，由江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn);TU-1201紫外可見光分光光度計(jì)，由北京普析通用儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn);GL—20G—Ⅱ型冷凍離心機(jī)，由上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn);101AS-2型不銹鋼數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱，F(xiàn)A1004電子天平等。

2 方法

2.1 蕨菜黃酮提取物與含量測(cè)定

蕨菜黃酮的提取參照文獻(xiàn)［2］進(jìn)行，將浸提液適當(dāng)濃縮到一定體積，呈漿狀，此為蕨菜總黃酮提取液。采用分光光度法測(cè)定蕨菜干粉中黃酮含量。

2.2 造模與分組

60只小鼠隨機(jī)分成正常組、模型組、蕨菜黃酮(PAF高、PAF中、PAF低)劑量組、維生素E組，均置于50 cm×30 cm的紙箱中霧化;除正常組給予自來水霧化外，其余各組均給予15 mg/mL二氧化硅粉塵混懸液，每天上、下午各霧化2 h，連續(xù)3 W;同時(shí)，于每天上午霧化前1 h，分別灌胃給予正常組、模型組自來水10 g/kg，PAF高、PAF中、PAF低劑量組分別灌胃給予PAF 200、100、50 mg/kg，維生素E組灌胃給予維生素E 60 mg/kg組，每天1次，連續(xù)3 W。

2.3 血液及肺組織不同指標(biāo)的測(cè)定

于末次霧化后，小鼠禁食14 h，分別稱小鼠體重，摘眼球取血，1358×g離心10 min，取上清液測(cè)MDA、SOD。小鼠頸椎脫臼處死，解剖，取其全肺，以醫(yī)用紗布吸凈肺表面液，稱重，根據(jù)其全肺重量及對(duì)應(yīng)小鼠體重算出該鼠的肺指數(shù)(肺指數(shù)=肺重/體重);然后取右肺下葉約2 mm×5 mm×10 mm大小肺組織置于福爾馬林液中固定，以待制作肺組織切片;取余下的肺組織進(jìn)行勻漿，勻漿液21734×g離心15 min，取上清液檢測(cè)肺組織SOD、MDA、GSHPx、Hyp值。硫代巴比妥酸法測(cè)MDA含量，鄰苯三酚自氧化速率法測(cè)SOD活力，GSH-Px活力、Hyp含量的檢測(cè)按試劑盒說明進(jìn)行。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SAS9.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 蕨菜黃酮含量的測(cè)定

以分光光度法測(cè)得提取的蕨菜干粉中蕨菜粗黃酮含量為6.182%。

3.2 蕨菜黃酮對(duì)染矽塵小鼠血清MDA、SOD的影響

見表1。與正常組相比，模型組血清MDA值顯著升高、SOD活力顯著下降(P＜0.05，P＜0.01);與模型組相比，蕨菜黃酮高、中劑量組血清MDA顯著降低(P＜0.01)，低劑量組有降低趨勢(shì)，但不顯著(P＞0.05)，蕨菜黃酮各組SOD活力顯著升高。

表1 蕨菜黃酮對(duì)染矽塵小鼠血清MDA和SOD的影響(n=10，±s)Table 1 Effect of P.aqulinum flavonoids on the serum levels of MDA and SOD in mice exposed to silica dust(n=10，±s)

表1 蕨菜黃酮對(duì)染矽塵小鼠血清MDA和SOD的影響(n=10，±s)Table 1 Effect of P.aqulinum flavonoids on the serum levels of MDA and SOD in mice exposed to silica dust(n=10，±s)

注：*P＜0.05，＊＊P＜0.01v正常組;△P＜0.05，△△P＜0.01v模型組Note：*P＜0.05，＊＊P＜0.01V normal group;△P＜0.05，△△P＜0.01V model group

組別Group 劑量Dose(mg/kg) MDA(O.D值) SOD(U/mL) Normal - 0.1103±0.0213 219±63.2模型組Model - 0.1353±0.0216* 121±45.8＊＊維生素E組Vitamin E 60 0.1011±0.0452 198±35.8△PAF低劑量PAF-L 50 0.1250±0.0373 190±48.3△PAF中劑量組PAF-M 100 0.0961±0.0165△△ 203±55△PAF高劑量組PAF-H 200 0.0922±0.0308△△ 202±51.3正常組△

3.3 蕨菜黃酮對(duì)染矽塵小鼠肺組織MDA、SOD、GSH-Px的影響

與正常組比較，模型組肺MDA顯著升高，SOD、GSH-Px活力顯著下降(P＜0.01);與模型組比較，蕨菜黃酮組肺MDA均顯著降低(P＜0.01)，SOD活力均有不同程度的升高(P＜0.01，P＜0.05)，蕨菜黃酮高、中劑量組肺GSH-Px活力顯著升高(P＜0.01，P＜0.05)。如表2。

表2 蕨菜黃酮對(duì)染矽塵小鼠肺組織MDA、SOD和GSH-Px的影響(n=10，±s)Table 2 Effect of P.aqulinum flavonoids on the lung tissues levels of MDA，SOD and GSH-Px in mice exposed to silica dust(n=10，±s)

表2 蕨菜黃酮對(duì)染矽塵小鼠肺組織MDA、SOD和GSH-Px的影響(n=10，±s)Table 2 Effect of P.aqulinum flavonoids on the lung tissues levels of MDA，SOD and GSH-Px in mice exposed to silica dust(n=10，±s)

注：*P＜0.05，＊＊P＜0.01v正常組;△P＜0.05，△△P＜0.01v模型組。Note：*P＜0.05，＊＊P＜0.01V normal group;△P＜0.05，△△P＜0.01V model group

組別Group 劑量Dose(mg/kg) MDA(O.D值) SOD(U/mL) GSH-Px(U/mL) Normal - 0.1891±0.0278 223±36.2 1903±356.1模型組Model - 0.2452±0.0534＊＊ 109±28.5＊＊ 1205±281.2＊＊維生素E組Vitamin E 60 0.2011±0.0432△ 171±46.8△ 1657±301.5△PAF低劑量PAF-L 50 0.1948±0.0282△△ 163±49.0△ 1421±265.0 PAF中劑量組PAF-M 100 0.1835±0.0461△△ 185±51.0△△ 1623±323.6△PAF高劑量組PAF-H 200 0.1901±0.0487△△ 190±44.0△△ 1812±411.8正常組△△

3.4 蕨菜黃酮對(duì)染矽塵小鼠肺組織Hyp、肺指數(shù)的影響

與正常組比較，模型組肺Hyp含量顯著升高，小鼠的肺指數(shù)明顯增大(P＜0.01);與模型組比較，蕨菜黃酮高、中劑量組肺Hyp含量顯著下降(P＜0.01，P＜0.05)，肺指數(shù)顯著下降(P＜0.05)。如表3。

表3 蕨菜黃酮對(duì)染矽塵小鼠肺組織Hyp和肺指數(shù)的影響(n=10，±s)Table 3 Effect of Pteridium aqulinum flavonoids on the lung tissues levels of Hyp and lung index in mice exposed to silica dust(n= 10，±s)

表3 蕨菜黃酮對(duì)染矽塵小鼠肺組織Hyp和肺指數(shù)的影響(n=10，±s)Table 3 Effect of Pteridium aqulinum flavonoids on the lung tissues levels of Hyp and lung index in mice exposed to silica dust(n= 10，±s)

注：*P＜0.05，＊＊P＜0.01v正常組;△P＜0.05，△△P＜0.01v模型組。Note：*P＜0.05，＊＊P＜0.01V normal group;△P＜0.05，△△P＜0.01V model group

組別Group 劑量Does(mg/kg) Hyp(μg/g) 肺指數(shù)Lung index(g/kg) Normal - 739±201.0 5.70±0.572模型組Model - 1313±328.3＊＊ 7.22±0.823＊＊維生素E組Vitamin E 60 909±208.3△ 6.41±0.625△PAF低劑量PAF-L 50 1125±299.0 6.63±0.388 PAF中劑量組PAF-M 100 933±287.0△ 6.35±0.692△PAF高劑量組PAF-H 200 829±231.2△△ 6.18±0.597正常組△

3.5 蕨菜黃酮對(duì)染矽塵小鼠肺組織切片的影響

與正常組相比，模型組間質(zhì)膠原纖維增生，間隔增厚，肺泡腔變窄，形成肺纖維化;且淺染區(qū)較正常組明顯縮小，而深染區(qū)明顯增多，并出現(xiàn)大量浸潤(rùn)性細(xì)胞。與模型組相比，蕨菜黃酮組肺組織間膠原纖維均有增生，但程度較輕;隨給藥劑量的降低，增生有加重趨勢(shì)。見圖1。

4 討論

在生理狀態(tài)下，機(jī)體氧化、抗氧化系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡當(dāng)中。一旦機(jī)體受到外來侵襲，如長(zhǎng)期接觸石英粉塵，引起機(jī)體氧化、抗氧化系統(tǒng)失衡，產(chǎn)生大量自由基及其降解產(chǎn)物，導(dǎo)致質(zhì)膜損傷，促進(jìn)纖維細(xì)胞增生和膠原合成，引起肺纖維化［1，3］;而這一結(jié)論已在臨床研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)［4，5］。本研究模擬自然條件下的矽塵環(huán)境，采用石英粉塵霧化吸入使小鼠染塵，結(jié)果模型組小鼠的氧化指標(biāo)SOD活力下降及脂質(zhì)過氧化物指標(biāo)MDA含量升高，抗氧化指標(biāo)GSH-Px活力下降，提示矽塵可誘導(dǎo)小鼠氧化應(yīng)激的發(fā)生。

圖1 蕨菜黃酮對(duì)染矽塵小鼠肺組織病理改變的影響Fig.1 Effect of Pteridium aqulinum flavonoids on the lung tissues pathological changes in mice exposed to silica dust

Hyp作為機(jī)體膠原蛋白的主要成分之一，其含量的高低可以作為衡量膠原組織代謝的重要指標(biāo)［6］;為此，本課題選取Hyp、肺指數(shù)及肺組織病理學(xué)作為判斷肺纖維化的指標(biāo)。研究表明，模型組小鼠Hyp、肺指數(shù)顯著升高，肺組織纖維化，提示染矽塵小鼠可能通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)了肺纖維化的形成。

實(shí)驗(yàn)中，蕨菜黃酮灌胃給藥3周，與模型組比較，高、中劑量組小鼠血清及肺組織MDA顯著下降，血清及肺組織SOD活力、肺組織GSH-Px活力有不同程度的升高，提示蕨菜黃酮對(duì)染矽塵小鼠具有良好的抗氧化作用;而肺組織Hyp含量的下降、肺指數(shù)的降低及肺組織病理的改變，表明蕨菜黃酮具有延緩染矽塵小鼠肺纖維化的作用，其機(jī)制可能與其改善氧化應(yīng)激有關(guān)。

綜上所述表明，蕨菜黃酮對(duì)染矽塵小鼠具有較好的抗氧化應(yīng)激及延緩肺纖維化的作用，可以作為防治矽肺的藥物進(jìn)行進(jìn)一步研究。

1 Mossman BT，Churg A.Mechanisms in the pathogenesis of asbestosis and silicosis.Am J Respir Crit Care Med，1998， 157：1666.

2 Chen NF(陳乃富).Study on the extraction of flavonoids compound in Pteridium aquilinum and antioxidative effect.Food Ferment Ind(食品與發(fā)酵工業(yè))，2003，29(9)：63-66.

3 Fubiui B，Hubbard A.Reactive oxygen species(ROS)and reactive nitrogen species(RNS)generation by silica in inflammation and fibrosis.Free Radic Biol Med，2003，34：1507-1516.

4 Zhang ZG(張中興)，Wu KG(吳開國(guó))，Yang L(楊莉)，et al.Levels of lipid peroxidation and antioxidation in silica exposed rats.Ind Health Occup Dis(工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病)，2006，32(2)：74-75.

5 Zhang XT(張雪濤)，Ni WM(倪為民)，Miu RM(繆榮明)，et al.Effects of oxidative stress and NF-kB levels in peripheral blood mononuclear cells on development of silicosis.Chin J Ind Hyg Occup Dis(中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志)，2011，29：251-254.

6 Lv XB(呂小波)，Yang DJ(楊東加)，Wu ZC(武正才)，et al.The therapeutic effects of polysaccharide from Bletilla striata on pneumociniosis in rat.J Yunnan Univ Tradit Chin Med(云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào))，2010，33(3)：35-37.

Effect of Pteridium aqulinum Flavonoids on Oxidative Stress and Lung Fibrosis in Mice Exposed to Silica Dust

GU Fang-li1，CHEN Nai-fu1，2*，DAI Jun21Departement of Biological and Pharmaceutical Engineering，West of Anhui University;2Anhui Province Plant Cell Engineering Technology Research Center，Liu’an，237012，China

To study the effect of Pteridium aqulinum flavonoids on oxidative stress and lung fibrosis effects in mice exposed to silica dust，the models of mice were established by ultrasonic nebulized inhalation of silica suspension.At the same time，P.aqulinum flavonoids were administrated to model mice.After three weeks，these indices were detected which were superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA)in blood and SOD，MDA，glutathione peroxidase (GSH-Px)and hydroxyproline(Hyp)in lung tissue，the lung mass coefficient was calculated，and the pathology of the right lung were observed.The results showed that MDA value in blood and lung tissue of P.aqulinum flavones group decreased significantly，SOD activity was significantly elevated，GSH-Px activity in lung tissue was significantly elevated，contents of Hyp in lung tissue and pulmonary index decreased significantly，and pulmonary fibrosis process was delayed.These results suggested that P.aqulinum flavones in mice exposed to silica dust has better antioxidant effect，retarded the process of pulmonary fibrosis.

Pteridium aqulinum flavonoids;silica;mice;oxidative stress;lung fibrosis

1001-6880(2012)04-0529-04

2011-10-08 接受日期：2011-12-07

安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(090413113);安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2009A165)

*通訊作者 Tel：86-564-3305073;E-mail：naifuchen1962@163.com

R285.5

A