蘆筍老莖澄清汁對(duì)鏈脲佐菌素致糖尿病大鼠降糖作用的研究

趙旌旌，趙洪軍，趙 頔，王潔瓊，瞿偉菁

華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海200062

蘆筍老莖澄清汁對(duì)鏈脲佐菌素致糖尿病大鼠降糖作用的研究

趙旌旌，趙洪軍，趙 頔，王潔瓊，瞿偉菁*

華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海200062

本文評(píng)價(jià)了蘆筍老莖澄清汁(CAJ)的降血糖作用，并對(duì)其降血糖機(jī)制進(jìn)行了初步探討。腹腔注射STZ制備類(lèi)似1型糖尿病大鼠模型，以0.6，1.2和2.0 g/kg體重劑量的CAJ連續(xù)灌胃21 d，監(jiān)測(cè)血糖，測(cè)定糖化血清蛋白、血清胰島素、肝糖原、脂代謝及抗氧化系統(tǒng)部分相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果顯示，CAJ可明顯降低糖尿病大鼠血清中葡萄糖、糖化血清蛋白、總膽固醇和MDA含量，并顯著提高受試模型鼠的血清胰島素水平、肝糖原含量、血清SOD活性、肝臟SOD、GSH-Px和CAT的活性。上述結(jié)果表明CAJ可明顯降低糖尿病大鼠的血糖水平，刺激胰島素分泌，調(diào)節(jié)血脂，增強(qiáng)抗氧化能力。

蘆筍老莖澄清汁(CAJ);鏈脲佐菌素;糖尿病大鼠;降血糖作用

蘆筍(Asparagus officinalis L.)，學(xué)名石刁柏，百合科天門(mén)冬屬多年生宿根性草本植物，是一種品味兼優(yōu)、藥食兼用的營(yíng)養(yǎng)保健名貴蔬菜。因其含有黃酮、多糖、皂苷和氨基酸［1］等多種活性物質(zhì)，故除食用外，蘆筍還具有多種生物學(xué)活性，如：抗氧化［2］、抗腫瘤［3］和降血脂［4］。上述活性研究均圍繞蘆筍可食部分嫩莖展開(kāi)，對(duì)于收割和加工過(guò)程中棄掉的約占原料35%的老莖關(guān)注甚少。有文獻(xiàn)報(bào)道，老莖中含有約50%的原汁［5］，本課題組前期研究確立了蘆筍老莖汁的最佳澄清工藝［6］，發(fā)現(xiàn)經(jīng)該工藝獲得的老莖澄清汁(clarified asparagus juice，CAJ)含有活性成分黃酮、多酚、皂苷和多糖［6，7］，在體外實(shí)驗(yàn)中可明顯清除羥基自由基和亞硝酸鹽、抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、并能有效抑制а-葡萄糖苷酶活性［7］。在此基礎(chǔ)上，本文進(jìn)一步研究了CAJ對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血糖和血脂代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 蘆筍澄清汁的制備［6］

取蘆筍棄料(老莖)洗凈晾干，殺青，置于榨汁機(jī)中壓榨取汁，用ZTC1+1澄清劑澄清處理后，濾紙過(guò)濾，獲取老莖澄清汁(CAJ)，減壓濃縮后冷凍干燥，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 動(dòng)物

雄性Wistar大鼠，體重190～210 g，購(gòu)自上海西普爾－必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(滬)2007-0016。

1.1.3 藥品與試劑

鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ，Sigma公司);格列苯脲(Glibenclamide，北京太洋藥業(yè)有限公司，批號(hào)：050503);血糖試紙條及血糖儀(美國(guó)雅培公司);其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。血清葡萄糖(serum glucose，Glu)、血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)試劑盒，購(gòu)自上海科欣生物技術(shù)研究所;超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(Catalase，CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-PX)、丙二醛(Malonyldiadehyde，MDA)、總抗氧化能力(Total antioxidant capacity，T-AOC)、肝糖原(Glycogen)、糖化血清蛋白(glycosylated serum protein，GSP)、肝臟已糖激酶(Hexokinase)測(cè)定試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所;蛋白測(cè)定試劑盒，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.1.4 儀器

梅特勒-托利多B-L系列電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，TL-16R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海市離心機(jī)械研究所)，T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用有限公司)，DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，XW-80A渦旋混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)等。

1.2 方法

1.2.1 STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型的制備

正常雄性Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，禁食12 h后，隨機(jī)分出14只作為正常對(duì)照組(Normal control)，其余大鼠根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果腹腔注射47 mg/kg B.W.劑量STZ(以0.1 mol/L，pH 4.6檸檬酸緩沖液配制，滅菌)，正常對(duì)照組注射等體積緩沖液。注射STZ將引起胰島素應(yīng)激性的大量分泌，引發(fā)致命的低血糖效應(yīng)，因此注射后的24 h需向大鼠補(bǔ)充3%的葡萄糖水溶液。注射后5 d，大鼠禁食8 h，尾靜脈采血，分離血清，測(cè)定空腹血清葡萄糖含量，血糖值大于10.0 mmol/L的大鼠選為類(lèi)似1型糖尿病大鼠。

1.2.2 分組與降糖實(shí)驗(yàn)

試驗(yàn)共分6組，除正常對(duì)照組外，糖尿病大鼠隨機(jī)分為5組，每組14只，分別為：模型對(duì)照組(Diabetic control)，格列苯脲組(Glibenclamide，Glib)、CAJ高、中、低劑量組。格列苯脲組大鼠按20 mg/ (kg B.W.·d)劑量灌胃給予(ig)格列苯脲;CAJ低、中、高劑量治療組分別按0.6 g/(kg B.W.·d)、1.2 g/(kg B.W.·d)和2.0 g/(kg B.W.·d)劑量ig CAJ;正常對(duì)照組和模型對(duì)照組ig等體積蒸餾水，連續(xù)21 d。每周測(cè)定空腹血清葡萄糖含量;21 d時(shí)，各組動(dòng)物禁食8 h，取血并處死，分離血清，取出肝臟用4℃生理鹽水沖洗，吸干多余水分。指標(biāo)測(cè)定前，所有樣品保存于-70℃。

1.2.3 生化指標(biāo)測(cè)定

血清中Glu、TC、TG、GSP含量，ALT、AST、ALP活性，肝臟已糖激酶活性按試劑盒說(shuō)明書(shū)方法測(cè)定;血清Ins含量采用放射免疫法測(cè)定，由復(fù)旦大學(xué)放射醫(yī)學(xué)研究所測(cè)定;采用糖原測(cè)定試劑盒測(cè)定肝糖原含量，操作步驟及計(jì)算方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4 抗氧化指標(biāo)測(cè)定

血清及肝臟SOD活性、MDA含量、肝臟CAT、TAOC、GSH-PX活性測(cè)定按試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行，組織蛋白含量按BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)方法測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

表1 CAJ對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠空腹血糖水平的影響Table 1 Effect of CAJ on fasting serum glucose level in STZ-induced diabetic rats

aP＜0.05，aaP＜0.01與糖尿病模型對(duì)照組相比，下同。aP＜0.05，aaP＜0.01 compared with diabetic control.The same below.

2 結(jié)果

2.1 CAJ對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血糖水平的影響

表1數(shù)據(jù)顯示：腹腔注射STZ誘導(dǎo)糖尿病模型后，大鼠空腹血糖水平極顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.01)。灌胃14 d及21 d時(shí)，模型組大鼠處于持續(xù)高血糖狀態(tài)，而與之相比，CAJ低劑量(0.6 g/kg)、中劑量(1.2 g/kg)及陽(yáng)性藥物格列苯脲(20 mg/kg)均顯著降低糖尿病大鼠的血糖水平(P＜0.05)，14 d時(shí)降糖率依次為38.00%，29.38%和39.38%，21 d時(shí)分別為37.02%，36.60%和39.64%，但CAJ高劑量組與對(duì)照相比差異不明顯(P＞0.05)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，給藥7、14和21 d時(shí)CAJ 3個(gè)劑量組血糖無(wú)顯著差異(P＞0.05)，提示CAJ具有一定的降血糖作用，但無(wú)劑量相關(guān)性。

2.2 CAJ對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠糖基化血清蛋白、血清胰島素、肝糖原含量及肝臟己糖激酶活性的影響

如表2數(shù)據(jù)所示：與正常對(duì)照組相比，糖尿病模型大鼠的GSP極顯著升高(P＜0.01);而血清Ins和肝糖原水平極顯著降低(P＜0.01)，已糖激酶活性顯著降低(P＜0.05)。連續(xù)給予0.6和1.2 g/kg的CAJ 21 d可明顯降低糖尿病大鼠的GSP水平(P＜0.01)，增加肝糖原含量(P＜0.05)，2.0 g/kg的CAJ作用不明顯(P＞0.05);1.2 g/kg CAJ可明顯提升糖尿病大鼠的血清胰島素水平和肝臟已糖激酶活性(P＜0.05)，而0.6和2.0 g/kg的CAJ作用不明顯(P＞0.05)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，CAJ 3個(gè)劑量組的糖化血清蛋白、血清胰島素、肝糖原和肝臟己糖激酶均無(wú)明顯差異，無(wú)劑量相關(guān)性。

表2 CAJ對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠糖基化血清蛋白、血清胰島素、肝糖原含量及肝臟己糖激酶活性的影響Table 2 Effect of CAJ on levels of serum GSP，insulin，hepatic glycogen and activity of hepatic hexokinase in STZ-induced diabetic rats

2.3 CAJ對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血脂及體重水平的影響

表3數(shù)據(jù)顯示：與正常組相比，模型對(duì)照組大鼠體重極顯著降低而血清TC水平極顯著升高(P＜0.01)。與模型對(duì)照組相比，給予0.6和1.2 g/kg的CAJ 21 d可明顯增加糖尿病大鼠的體重(P＜0.01，P＜0.05);1.2 g/kg CAJ還能極顯著降低糖尿病大鼠的血清TC水平(P＜0.01)，而CAJ 3個(gè)劑量組間的血清TC水平無(wú)明顯差異(P＞0.05)。

表3 CAJ對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠體重、血清甘油三酯和總膽固醇水平的影響Table 3 Effect of CAJ on body weight，serum TG and TC levels in STZ-induced diabetic rats

糖尿病模型對(duì)照Diabetic control 248.20±18.68 234.87±18.01 1.34±0.45 1.54±0.21格列苯脲Diabetic+Glib 248.93±14.65 274.86±21.22aa 1.55±0.38 1.43±0.16 CAJ低劑量Diabetic+CAJ 0.6 247.29±15.34 277.38±19.62aa 1.34±0.63 1.40±0.18 CAJ中劑量Diabetic+CAJ 1.2 246.86±22.81 258.86±22.16a 1.16±0.56 1.30±0.12aa CAJ高劑量Diabetic+CAJ 2.0 249.79±13.70 254.69±23.45 1.39±0.57 1.46±0.22

2.4 CAJ對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血清ALP、ALT和AST活性的影響

與正常對(duì)照組相比，糖尿病對(duì)照組大鼠血清ALP、ALT及 AST活性極顯著升高(如表4，P＜0.01)，提示模型大鼠肝臟受損，連續(xù)給予0.6和 1.2 g/kg的CAJ 21 d可明顯降低糖尿病大鼠血清ALP活性(P＜0.01，P＜0.05)，使之趨向正常水平;同時(shí)0.6 g/kg CAJ還能顯著降低糖尿病大鼠的血清ALT水平(P＜0.05);CAJ各劑量對(duì)模型大鼠血清AST活性影響不明顯(P＞0.05)。

表4 CAJ對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血清ALP、ALT和AST活性的影響Table 4 Effect of CAJ on activities of serum ALP，ALT and AST in STZ-induced diabetic rats

2.5 TMP對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠抗氧化能力的影響

表5結(jié)果顯示：與正常大鼠相比，糖尿病模型對(duì)照組大鼠血清和肝臟的抗氧化酶SOD，CAT和GSHPx活性明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)，而血清MDA含量顯著升高(P＜0.05)，表明STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型具有明顯的氧化損傷。連續(xù)給予0.6 g/kg CAJ 21d可顯著增加糖尿病大鼠血清 SOD(P＜0.05)和肝臟CAT和GSH-Px活性(P＜0.01)，并能明顯降低血清MDA含量(P＜0.05);1.2 g/kg CAJ可明顯增強(qiáng)糖尿病大鼠血清SOD，肝臟SOD，CAT和GSH-Px活性(P＜0.05或P＜0.01)，并能顯著降低血清MDA含量(P＜0.05)。

表5 CAJ對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血清和肝臟部分抗氧化指標(biāo)的影響Table 5 Effect of CAJ on antioxidant parameters in serum and liver of STZ-induced diabetic rats

3 討論

STZ誘導(dǎo)的類(lèi)似1型糖尿病動(dòng)物模型是常見(jiàn)的評(píng)價(jià)降血糖藥物的模型，該模型具有高血糖、胰島素缺乏的癥狀;同時(shí)，由于胰島素缺乏，脂解作用上升，有時(shí)甘油三酯和總膽固醇也會(huì)出現(xiàn)升高［8］。采用這一模型，本文研究了CAJ對(duì)類(lèi)似1型糖尿病大鼠的影響。結(jié)果顯示：通過(guò)口服途徑，CAJ可有效降低類(lèi)似1型糖尿病大鼠空腹血清葡萄糖和糖化血清蛋白水平，表現(xiàn)出顯著的降血糖活性。糖化血清蛋白(GSP)是血液中葡萄糖與白蛋白及其它蛋白質(zhì)分子末端的氨基發(fā)生非酶促糖化反應(yīng)形成的具有酮胺鍵的糖化蛋白，可反映最近2～3周內(nèi)的平均血糖水平，而和采血時(shí)的血糖濃度并不相關(guān)［9］，本研究結(jié)果表明0.6和1.2 mg/kg CAJ在1型糖尿病動(dòng)物模型上的降糖作用是持續(xù)穩(wěn)定的。高血糖是糖尿病的核心癥狀［10］，目前，糖尿病治療的最主要目標(biāo)還是有效控制血糖水平，0.6和1.2 mg/kg CAJ可明顯抑制糖尿病大鼠血糖水平的上升，提示其可能對(duì)糖尿病的發(fā)展有一定的控制作用。

本研究中，1.2 mg/kg CAJ使類(lèi)似1型糖尿病大鼠的血清胰島素水平明顯上升(P＜0.05)，提示CAJ可刺激大鼠胰島素分泌，其降血糖作用可能通過(guò)刺激胰島素分泌這一途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)。

肝臟糖原的分解與合成途徑也是血糖水平的一個(gè)重要調(diào)節(jié)點(diǎn)。在糖尿病的狀態(tài)下，肝臟合成糖原的能力減弱［11］。有研究顯示STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠肝糖原含量顯著低于正常大鼠［12］。本研究中，模型大鼠肝糖原含量顯著低于正常大鼠，而0.6和1.2 mg/kg CAJ可明顯增加模型大鼠的肝糖原含量，提示CAJ可能通過(guò)刺激葡萄糖的外周組織利用來(lái)調(diào)節(jié)糖尿病大鼠的血糖水平，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

活性氧自由基導(dǎo)致胰島β細(xì)胞氧化損傷是STZ引發(fā)高血糖的重要原因，氧化損傷也會(huì)導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展［13］，由于抗氧化系統(tǒng)與自由基和氧化損傷密切相關(guān)，本文觀測(cè)了CAJ對(duì)高血糖狀態(tài)下的糖尿病大鼠部分氧化酶活性及MDA含量的影響。結(jié)果顯示：0.6和1.2 mg/kg CAJ可增強(qiáng)模型大鼠降低的血清和肝臟SOD活性、肝臟CAT和GPx活性;降低血清中MDA含量，提示CAJ可能通過(guò)提高SOD、CAT和GSH-Px的活性來(lái)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)生，從而緩解STZ對(duì)胰島β細(xì)胞的氧化損傷，或通過(guò)促進(jìn)已損傷的β-細(xì)胞修復(fù)來(lái)增強(qiáng)胰島素的分泌，從而緩解血糖升高。

本研究結(jié)果顯示：所設(shè)定的CAJ三個(gè)劑量0.6、1.2 mg/kg和2.0 mg/kg并無(wú)顯著的劑量依賴(lài)性，其中1.2 mg/kg CAJ在降糖、降膽固醇活性、刺激胰島素分泌和增加肝糖原含量方面作用明顯，是最佳劑量，而高劑量2.0 mg/kg CAJ的作用不明顯。推測(cè)這一結(jié)果可能是由于CAJ是混合物，其中的一些成分影響了降糖活性成分的吸收與代謝所致。

有研究表明，STZ對(duì)高血糖大鼠肝臟產(chǎn)生毒性，導(dǎo)致存在于肝細(xì)胞內(nèi)的AST、ALT、ALP等進(jìn)入血液［14］。但也有學(xué)者指出，這類(lèi)參與糖異生作用的酶，活性受胰島素抑制，故其活性變化不僅反映肝臟損傷，也反映胰島素信號(hào)的強(qiáng)弱［15］。本研究中，與正常大鼠相比，模型大鼠血清AST、ALT和ALP活性顯著升高，可能由STZ造成的肝臟損傷引發(fā)，口服CAJ后，血清ALT和ALP活性顯著下降，推測(cè)CAJ可能通過(guò)促進(jìn)胰島素分泌來(lái)抑制ALT和ALP的活性，也可能通過(guò)提高機(jī)體抗氧化保護(hù)酶活性、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化來(lái)緩解STZ對(duì)肝臟細(xì)胞的氧化損傷，從而減少了ALT和ALP進(jìn)入血液，使之活性降低。

綜合上述結(jié)果，CAJ可能通過(guò)刺激胰島素分泌、增加外周組織對(duì)糖的利用以及增強(qiáng)抗氧化能力的途徑來(lái)降低STZ誘導(dǎo)的類(lèi)似1型糖尿病模型動(dòng)物的血糖水平，其降血糖作用的分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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Hypoglycemic Activity of Clarified Asparaagus Juice in Streptozotocin Induced Diabetic Rats

ZHAO Jing-jing，ZHAO Hong-jun，ZHAO Di，WANG Jie-qiong，QU Wei-jing*
School of Life Science，East China Normal University，Shanghai 200062，China

The present study was designed to evaluate the hypoglycemic effect of clarified juice of woody stem Asparagus officinalis L.(CAJ)in streptozotocin(STZ)-induced diabetic rats.Diabetes in rats was induced by a single intraperitoneal injection of STZ.0.6，1.2 and 2.0 g/kg body weight CAJ were orally administered to diabetic rats once a day lasting for 21 days.Results showed that administration of CAJ significantly lowered the fasting serum glucose，glycosylated serum protein，total cholesterol and malondialdehyde levels in diabetic rats，but markedly increased serum insulin level，hepatic glycogen content，activities of superoxide dismutase in serum and liver and activities of hepatic glutathione peroxidase and catalase.These results suggested that CAJ might have hypoglycemic，insulin-stimulating，hypotriglyceridemic and antioxidant effects in STZ induced diabetic rats.

clarified asparagus juice(CAJ);streptozotocin;diabetic rats;hypoglycemic activity

1001-6880(2012)04-0460-06

2011-07-18 接受日期：2011-11-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(61172149)

*通訊作者 Tel：86-21-62232019;E-mail：wjqu@bio.ecnu.edu.cn

R151.2;Q946.8

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