棉葉中棉酚的快速提取與測定方法研究

景偉文，遆曉南，陳燕勤，張坤馳，劉 喜

新疆農業大學化學工程學院化學生物學研究室，烏魯木齊830052

棉葉中棉酚的快速提取與測定方法研究

景偉文，遆曉南*，陳燕勤，張坤馳，劉 喜

新疆農業大學化學工程學院化學生物學研究室，烏魯木齊830052

棉酚(G)及其相關物甲氧基半棉酚(DHG)、半棉酚酮(HGQ)、半棉酚(HG)、殺實夜蛾素(H1-4)等是棉花中重要的抗蟲性萜烯類次生物質。利用高效液相色譜法(HPLC)對棉酚及其相關物進行了分離，測定了棉葉中的棉酚含量，討論了不同的提取方法和測定條件對結果的影響，給出了一套簡便、快速的分析測試方法，同時與紫外-可見分光光度法(苯胺法)的結果進行了對比，認為對于棉花的抗蟲性的研究來說，HPLC是比較適宜的方法。

棉酚;HPLC;苯胺比色法

萜烯類物質是棉葉中最重要的抗蟲性次生物質之一，這些物質包括棉酚(G)及其相關物甲氧基半棉酚(DHG)、半棉酚酮(HGQ)、半棉酚(HG)、殺實夜蛾素(H1-4)等［1］。研究表明，棉葉色素腺體內的棉酚等次生物質對棉花害蟲如棉鈴蟲的生長發育具有明顯的抑制作用，當棉酚含量達到一定值時，蟲體內的解毒活力就會受到抑制，昆蟲幼蟲的正常生長受到影響最終導致幼蟲死亡［2-5］。因此，為了解棉花品種的抗蟲性，探明萜烯類物質在棉株體內的含量分布情況，尤其是在棉葉中積累的時間變化特性，必須建立一種有效的分析測試方法。

關于棉酚測定的方法很多，最為常用的是紫外-可見分光光度法和色譜法［6-9］。目前文獻中介紹的液相色譜分析方法，有的如國標法，適合于植物油或以棉籽餅為原料的食品中游離棉酚的測定［10，11］;有的如張永軍等將植物樣品加提取液振蕩2小時后離心，減壓濃縮氮氣吹干定容過濾后進行測定，方法可以對多組分同時定量但樣品的處理稍嫌繁瑣費時［12］。本文著重對棉葉樣品的提取進行了討論，篩選出一種便捷、易行的前處理方法，同時利用HPLC法對棉葉中各種萜烯類物質進行分離，測定了棉酚物質的含量，并將其結果與紫外-可見分光光度法(苯胺法)比較，為分析方法的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試棉花為盆栽棉花(新陸早17)，常規管理，生長期不使用任何農藥。

棉葉樣品采集后去除水分，磨碎過篩(40目)備用。

1.2 儀器與試劑

島津LC-20AB型高效液相色譜儀，SPD-M20A檢測器，色譜柱：C18柱(5 μm，4.6×150 mm)，普析通用TU-1810型紫外可見分光光度計，超聲清洗器，振蕩器，離心機，粉碎機。

圖1 棉株中的萜烯類物質［1］Fig.1 Terpenoids in cotton［1］

棉酚標準樣品：購自 Sigma公司(批號106K4013，95%以上)。稱取純棉酚0.0117 g，以提取溶劑溶解、定容至100 mL容量瓶中，得到濃度為117.0 mg/L的儲備液。再以提取溶劑將儲備液稀釋成濃度為35.1 mg/L的標準工作液。分別取此工作液2、4、6、8、10 mL稀釋至25 mL容量瓶中，得到濃度分別為2.8、5.6、8.4、11.2、14.0 mg/L的標準溶液。其余所用甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、乙酸、NN二甲基甲替酰胺、磷酸、正己烷、丙酮、四氫呋喃等均為色譜純試劑(上海星可生化有限公司)。

1.3 樣品的處理

1.3.1 HPLC法

稱取粉碎樣品0.1 g左右(精確至0.0001 g)于具塞離心管中，加入提取溶劑超聲-振蕩提取后離心，取上清液過濾后進行測定。

表1 樣品不同除水處理方式的影響Table 1 The result of different dehydrated cotton samples

1.3.1.1 樣品不同除水處理方式的影響

分別采用以下幾種方式對樣品進行除水處理，所測結果如表1。

測定結果表明，真空冷凍干燥處理的樣品測定所得色譜峰面積最大。真空冷凍干燥法水分去除徹底，且低溫不破壞組分，所測結果應該最為可靠，但是儀器設備投資比較大。低溫烘干法的結果與真空干燥法相近，且簡單易行，故應用廣泛。

1.3.1.2 提取過程的影響

1.3.1.2.1 提取溶劑的確定

常溫下，純棉酚呈黃色晶體，易溶于乙醇、乙醚、丙酮和三氯甲烷等有機溶劑，不溶于水、己烷及低沸點的石油醚。故此，在分析檢測棉酚的過程中，常用這些有機溶劑來提取或分離棉酚。不同的提取溶劑由于極性的不同導致提取結果的不同。分別以乙腈+水+磷酸、無水乙醇、乙酸乙酯∶正己烷(1∶3)、70%丙酮、四氫呋喃為提取溶劑進行提取后進行測定，所得試驗數據表明，以乙腈+水+磷酸為提取劑時所得色譜峰峰形最佳，面積最大。另外，棉酚在乙腈中的穩定性也比較好，且該提取溶劑與流動相互溶性好，最終確定為合適的提取液。

1.3.1.2.2 提取方式的選擇

比較了常用的冷浸過夜、振蕩和超聲等提取方式的異同，結果顯示，以振蕩15 min+超聲15 min的提取方式效果較好。

1.3.1.2.3 提取液的處理

采用兩種方式對提取液進行處理：a.提取液離心分離出上清液，氮氣吹干，用5 mL提取溶劑沖洗定容后測定;b.提取液離心分離后直接進行測定。試驗結果表明，b的結果高于a。前處理的步驟，如樣品轉移、沖洗等會導致樣品當中棉酚含量的損失，因此采取提取后直接測定的方法比較簡便、適宜。

1.3.2 紫外可見分光光度計法(Smith-苯胺法)

稱取粉碎樣品0.1 g左右(精確至0.0001 g)置于250 mL帶塞三角瓶中，加20 mL玻璃珠(6 mm)，再加3 mL抗壞血酸溶液(3 g抗壞血酸溶于45 mL溶液A及0.5 mL濃鹽酸，混勻;溶液A：715 mL乙醇用水稀釋至1000 mL，加冰醋酸0.2 mL及200 mL乙醚)振搖，3 min后葉綠素褪色，加提取溶劑超聲-振蕩提取，減壓抽濾，漏斗及濾紙用少量的溶劑沖洗。濾液置于50 mL容量瓶中，用提取溶劑稀釋至刻度，取此液5 mL(雙份，分別記為a、b)，置于25 mL容量瓶中，同時取提取溶劑5mL(雙份，分別記為a0、b0)置于25 mL容量瓶中，向b、b0中加入0.5 mL新蒸苯胺，置于75℃水浴加熱40 min，冷卻后與a、b一起以提取溶劑稀釋至刻度，測定吸光度［13］。

1.4 測定條件

1.4.1 HPLC法

流動相：乙醇/甲醇/異丙醇/乙腈/水/乙酸乙酯/N，N-二甲基甲替酰胺/磷酸(V/V=16.7/4.6/ 12.1/20.2/37.4/3.8/5.1/0.1)，等度洗脫;流速：1.0 mL·min-1;檢測波長：272 nm;柱溫：55℃;進樣量20 μL。

1.4.2 紫外可見分光光度計法(Smith-苯胺法)

以a0為參比測定空白測定液b0的吸光度A0，以a為參比測定試樣測定液b的吸光度A，A-A0為校正的試樣溶液吸光度值。測定波長445 nm。

2 結果與分析

2.1 HPLC法

2.1.1 流動相的選擇

對于棉酚的分析測定，文獻上多采用甲醇-水或四氫呋喃+水作為流動相，但是棉酚在四氫呋喃或甲醇組成的溶劑中并不穩定，隨放置時間的延長，雜質峰逐次增大，主峰逐次減小。同時，這些簡單的流動相只能分離出棉酚組分，不能同時分離出HG、HGQ和H1-4這些結構上與棉酚非常相近的萜烯類次生物質，因而難以同時對這些物質進行測定。經嘗試，采用甲醇/乙醇/異丙醇/乙腈/水/乙酸/N-N二甲基甲替酰胺/磷酸(16.7/4.6/12.1/20.2/37.4/ 3.8/5.1/0.1)作為復合流動相，可以對棉花中的多種萜烯類化合物進行高效分離，達到測定目的。棉酚的紫外吸收峰有多個，包括254 nm、272 nm等，其中在272 nm處的吸收峰干擾少，靈敏度高，故選擇272 nm處為測定波長。

在以上確定的提取與測定條件下，所得譜圖(見圖 2)與文獻中的譜圖相比，確定組分峰名［1，12，14］。

圖2 樣品的HPLC色譜圖Fig.2 The HPLC chromatograph of terpenoids in cotton samples

2.1.2 樣品預處理

提取溶劑的選擇要保證既能得到較高的提取率，同時又要考慮到樣品中基體物質的干擾。另外，進行HPLC測定時還需考慮要與流動相相容。綜合以上因素，選擇乙腈+水+磷酸為提取劑。由于棉酚為一多羥基酚化合物，遇光、熱易氧化變質，故多采用冷浸或超聲提取的方式，否則會造成棉酚的損失。相比于冷浸法，超聲提取由于其固有的空化作用，效率較高。結合常溫振蕩方式機械破壞植物細胞結構，有助于提取充分。棉酚結構式中含有醛基和羥基，化學性質很活潑，極易被氧化而變質，因此提取時間不宜過長。由于超聲提取效率較高，亦可相應縮短提取時間。

2.1.3 標準曲線和靈敏度

利用外標法定量。將配制好的棉酚標準溶液(2.8、5.6、8.4、11.2、14.0 mg/L)進行測定，以棉酚標準品質量濃度x(mg/L)為橫坐標，峰面積y為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為y=50835x-16681，R2=0.9999，由此表明棉酚在上述質量濃度范圍內線性良好。棉酚的最低檢出限為8.5 ng(按20 μL計)。

2.1.4 平行性與重復性測定

稱取六份樣品各0.1 g左右，低溫烘干后過40目篩，以乙腈+水+磷酸為提取劑，振蕩15 min+超聲15 min提取，離心分離后測定棉酚的含量，所得數據如表2。

表2 棉酚HPLC法平行性的測定Table 2 The reproducibility of gossypol in samples for HPLC

2.1.5 加標回收率測定

稱取樣品按上述確定的條件(2.1.4)進行提取和測定，在標準曲線上查出樣液中棉酚的濃度;再次在提取液中分別加入棉酚標液(2.8 mg/L、8.4 mg/ L、14.0 mg/L)各1.0 mL進行測定，從標準曲線上查得加標后濃度，按下式計算回收率［15］，所得回收率為86.4%～93.4%(見表3)。

加標回收率(%)=(樣液加標后物質的量-樣液中物質的量)/標液中物質的量×100%

表3 棉酚回收率的測定(HPLC)Table 3 Recovery determination for gossypol(HPLC)

2.2 紫外-可見分光光度法

選擇不同的提取溶劑(70%丙酮、無水乙醇、乙醚、溶劑A)按照上述方法(1.3及1.4)進行提取和測定。結果表明，以溶劑A作提取劑時所得吸光度值為最大。因此，以溶劑A作提取劑，振蕩15 min +超聲15 min提取后測定樣品中棉酚的含量，所得結果見表4。

表4 紫外-可見分光光度法平行性的測定Table 4 The reproducibility of samples for UV spectrum

3 樣品的測定

采用上述HPLC法對一定生長時期的棉花葉片樣品中的棉酚含量進行了測定，所得結果如圖3。結果顯示，在棉花生長過程中，棉酚含量表現出一定程度的起伏，表明在棉株不同的發育時期棉葉內次生物質棉酚的含量有所不同。

圖3 棉葉中棉酚的動態變化Fig.3 The dynamic variations of gossypol in cotton leaves

4 討論

目前，分光光度法在國內外應用較普遍。Smith-苯胺法利用棉酚中含有的芳香醛結構與苯胺反應形成黃色物質進行比色測定，棉株中所有的含芳香醛基的物質均可與苯胺發生此反應，因此測得的實際是樣品提取液中萜烯類物質的總和，還包括棉酚的磷脂衍生物和親水棉酚衍生物等在一定波長下吸光度的總和，對棉酚不具有專一性，因此使得結果偏高。經F統計檢驗，HPLC法所測結果與Smith-苯胺法比色法所得結果存在顯著性差異。HPLC法是將棉酚與其他物質分離后進行測定的，因此，對于寄主植物的抗性研究來說，HPLC法應該是比較可靠的方法。當然，提取溶劑的不同對結果亦會產生一定的影響。

長期以來，對棉葉中萜烯類物質的測定工作主要集中在對棉酚的測定上。事實上，棉酚并不是棉葉中唯一的萜烯類次生物質。因此，僅對棉酚含量進行測定對于抗蟲性的研究來說是遠遠不夠的。本文對以往測定棉酚的方法進行了改進，建立的前處理及HPLC法簡便、快捷而準確。同時，該方法能夠對棉葉中各個萜烯類次生物質進行分離，在此基礎上，才能實現對各個萜烯類物質的含量測定。這對于進一步弄清萜烯類物質與棉花抗蟲性之間的關系，以便達到更好地抗性調節的目的是非常有益的工作，亦是作者今后努力的方向。

1 Stipanovic RD，Altman DW，Begin DL，et al.Terpenoid Aldehydes in upland cottons：analysis by aniline and HPLC methods.J Agric Food Chem，1988，36：509-515.

2 Wang CZ(王琛柱).Effects of gossypol and tannic acid on the growth and digestion physiology of cotton bollworm larvae.Acta Phytophyl Sin(植物保護學報)，1997，24：10-18.

3 Fei Y(費躍)，Guo CZ(郭長佐)，Huang ZY(黃志勇)，et al.Effects of gossypol on the growth of cotton bollworm.China Cotton(中國棉花)，1997，24(4)：21.

4 Hedin PA，Parrott WL，Jenkins JN.Relationships of glands，cotton square terpenoid aldehydes and other allelochemicals to larval growth of Heliothis virescens(Lepidoptera：Noctuidae).J Econ Entomol，1992，85：359-364.

5 Ti XN，Zhang KC.Advances in research of induced resistance to insects in cotton.Front Biol China，2009，3：1673-3622.

6 Huang TB(黃天寶)，Wang LR(王立人)，Liu GL(劉桂蘭)，et al.Determination of residual gossypol in cotton seed cake by reversed-phase HPLC.Chin J Anal Chem(分析化學)，1989，1：1025-1027.

7 Lu DQ(盧定強)，Duan L(段柳)，Wu YS(吳雅霜)，et al.RP-HPLC determination of gossypol acetate.Chin J Pharm Anal(藥物分析雜志)，2008，28：1562-1564.

8 Ao WP(敖維平)，Qu MY(曲明悅).Election appropriate conditions of rapid measurement for free gossypol.J Anim Sci Vet Med(畜牧獸醫雜志)，2007，6(26)：23-25.

9 Wen H(文虹).Determination of the content of free gossypol by reversed-phase HPLC.Jiangxi Feed(江西飼料)，1999，6：21-22.

10 GB/T 17334—1998(國標法)，Determination of free gossypol in foodstuff(食品中游離棉酚的測定).

11 GB/T 5009.148—2003(國標法)，Determination of free gossypol in phytogenic foodstuff(植物性食品中游離棉酚的測定).

12 Zhang YJ(張永軍)，Wang WG(王武剛)，Guo YY(郭予元).Analysis of terpenoids and their spatio-temporal expression of content in Bt transgenic cotton by HPLC method.Chin J Appl Environ Biol(應用與環境生物學報)，2001，7：37-40.

13 GB/T 5009.37—2003(國標法)，Method for analysis of hygienic standard of edible oils(食用植物油衛生標準的分析方法).

14 Altman DW，Stipanovic RD，Benedict JH.Terpenoid aldehydes in upland cottons.П.Genotypes-environment interactions.Crop Sci，1989，29：1451-1456.

15 Wu SH(吳樹宏)，Zhou CH(周春華).Discussion on calculation of recovery.GANSU Environ Study Monit(甘肅環境研究與監測)，2000，13：179-180.

Quick Extraction and Analysis of Gossypol in Cotton Leaves

JING Wei-wen，TI Xiao-nan*，CHEN Yan-qin，ZHANG Kun-chi，LIU Xi
The Laboratory of Chemical Biology，Department of Chemical Engineering，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China

The terpenoids in cotton contain a unique group of secondary metabolites，which include desoxyhemigossypol (DHG)，hemigossypolone(HGQ)，hemigossypol(HG)，gossypol(G)，and heliocides H1，H2，H3and H4(H1-4).These compounds have been shown to be important in protecting the plant from cotton insects.An HPLC method has been utilized for separating individual terpenoid and quantitating gossypol in cotton leaves.Some influencing factors，such as extracting and pre-treating process，were discussed and a set of simple，rapid method was developed.At the same time，the result of the UV-visible spectrophotometry(aniline method)was described and compared.The results showed that HPLC analysis was more reasonable for the insect-resistance investigation in cotton.

gossypol;aniline method;HPLC

1001-6880(2012)04-0498-05

2010-09-07 接受日期：2011-03-17

國家自然科學基金項目(30760135)

*通訊作者 Tel：86-991-8762831;E-mail：tixiaonan@163.com

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