應用高速逆流色譜分離桑枝酚類成分

羅 雋，孫培文，劉 韶*，李新中*

1中南大學湘雅醫院藥劑科，長沙410008;2中南大學藥學院，長沙410010

應用高速逆流色譜分離桑枝酚類成分

羅 雋1，2，孫培文1，2，劉 韶1，2*，李新中1，2*

1中南大學湘雅醫院藥劑科，長沙410008;2中南大學藥學院，長沙410010

建立了高速逆流色譜(HSCCC)分離制備高純度的桑枝酚類成分的新方法。分離條件如下：溶劑系統為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶1∶1∶2，v/v)，上相為固定相，下相為流動相;流速2.0 mL/min;轉速900 rpm;進樣量75 mg。收集得到三個高純度化合物，經HPLC、MS、1H和13C NMR等分別鑒定為反式氧化白藜蘆醇(25.2 mg)，反式白藜蘆醇(7.4 mg)和桑辛素M(29.1 mg)。高速逆流色譜可以高效分離桑枝成分，方法簡便，技術可行，優于傳統的柱色譜法。

HSCCC;桑枝;酚類;氧化白藜蘆醇;白藜蘆醇;桑辛素M

桑枝Ramulus mori.為?？浦参锷orus alba L.的干燥嫩枝，臨床上可用于類風濕性關節炎、高血壓、高血脂等多種疾病的治療，另有抗黑色素生成、抗氧化作用，其中主要的活性成分就是酚類化合物［1，2］。現有關于桑枝化學成分的研究較多，但一般采用柱色譜進行分離純化［3-5］，分離周期長，操作過程復雜，而且重現性不好。

高速逆流色譜(High-speed Counter-current Chromatography，HSCCC)是一種不使用固相支撐體或載體的液液分配色譜技術，不僅分離時間短，費用低，還避免了固相載體帶來的樣品預處理要求高和不可逆吸附帶來的樣品損失、失活變性等，因而在植物有效成分的分離與提純方面得到了廣泛的應用［6］。為獲得桑枝中高純度的單體化合物，我們應用HSCCC分離技術對桑枝提取物進行了分離純化，得到了至少三種酚類化合物。

1 儀器與材料

1.1 儀器

TBE-300A高速逆流色譜儀(上海同田生化技術有限公司);?KTA prime泵及紫外檢測系統(美國GE公司);HX21050恒溫器(北京博醫康實驗儀器有限公司);Agilent-1100型高效液相色譜儀;INOVA-400核磁共振儀(美國Varian公司);HCT型離子阱質譜儀(德國Bruker公司)。

1.2 材料

聚酰胺(80～100目，浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠);聚酰胺薄膜(5×10 cm，浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠);超純水;甲醇(色譜純，TEDIA COMPANY，INC.);其余試劑為分析純。桑枝飲片(產地湖南，批號2009081404，湖南振興中藥飲片廠加工，由湘雅醫院藥劑科劉韶副教授鑒定為桑的干燥嫩枝(Ramulus mori.)。

2 實驗方法

2.1 粗提物的制備

1 kg桑枝用70%的乙醇回流提取兩次，第一次8000 mL，提取時間為2 h，第二次6000 mL，提取時間為1 h，合并提取液，減壓濃縮至500 mL。將部分濃縮液(約120 mL，預先拌樣)加到裝有150 g預處理過的聚酰胺的層析柱(95 cm×4 cm，i.d.)上，分別用水、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇洗脫，將95%乙醇洗脫液減壓濃縮至干，得到固體430 mg (待分離樣品)，置干燥器內保存，備用。

2.2 HSCCC方法

2.2.1 兩相溶劑系統及樣品溶液的制備

HSCCC溶劑系統為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶1∶1∶2，v/v)，將其按比例配制混合于分液漏斗中并劇烈震蕩，分相平衡后分離出上下相并分別超聲脫氣，備用。另稱取75 mg粗提物，加入上下相各5 mL，振蕩使之完全溶解，備HSCCC分離。

2.2.2 分配系數K值的測定

從溶劑系統中各取等量上下相溶劑置于試管中，加入適量桑枝提取物，震蕩混勻，靜置分層后分別采用2.3中HPLC條件檢測，觀察各成分在兩相溶劑中的分配情況。分配系數K=CS/CM，其中CS指溶質在固定相中濃度，CM指溶質在流動相中濃度，兩者之比等于HPLC中峰面積之比，即K=AS/ AM。適宜的兩相溶劑體系應是組分的分配系數K在0.5～2之間，該方法可用來進行溶劑系統的篩選。

2.2.3 HSCCC分離

開啟泵，以最大流速將固定相泵入HSCCC色譜分離柱中至滿，開啟柱溫箱升溫至25℃，同時打開主機，選擇主機旋轉方向為正轉，緩慢調節速度由低至高直達900 rpm，保持平穩旋轉，以2.0 mL/min流速泵入流動相，待流動相從出柱口流出，兩相系統在柱中已經建立動態平衡后開始進樣。將樣品溶液通過進樣環注入主機管路，280 nm下檢測，接收流分。

2.3 HPLC分析

應用該HPLC色譜條件篩選溶劑系統并比較HSCCC中流分的純度和出峰時間。色譜柱為Ultimate XB-C18column(5 μm，250 mm×4.6 mm i.d.)，(Welch，America)，柱溫30℃，檢測器為紫外檢測器，檢測波長為285 nm，流動相為甲醇-水梯度洗脫，洗脫程序為：0～10 min，30%～40%MeOH;10～20 min，40%～60%MeOH;20～25 min，60%MeOH，進樣體積為10 μL，流速1.0 mL/min。用面積歸一化法判定含量。

3 結果與討論

3.1 HSCCC分離條件的優化

3.1.1 溶劑系統的優化

備選溶劑系統有正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水①(1∶1.5∶1∶2，v/v)、②(1∶0.5∶1∶2，v/v)、③(1∶1∶1∶2，v/v)、④(1∶0.9∶1∶2，v/v)。通過分配系數K值的測定，溶劑系統①的K值過大，不僅耗時長且分離度也沒有得到很好的改善;溶劑系統②K值過小，出峰時間太快，各峰分離度較差;溶劑系統③和④的K值在最佳范圍內，但溶劑系統③的分離度和峰形較好，分離效果最優，因此選擇③正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(1∶1∶1∶2，v/v)作為本實驗分離純化的溶劑系統。

3.1.2 其它參數的優化

分別對轉速(850 rpm，900 rpm)和進樣量(50 mg，75 mg，100 mg)進行了優化。結果表明，轉速較高時能提高固定相保留率，保證好的分離效果;進樣量增加可以提高實驗效率，但進樣量為100 mg時，固定相保留率降低且分離效果也下降很多。因此選用轉速為900 rpm和進樣量為75 mg的條件。

3.2 HSCCC分離制備結果

圖1 高速逆流色譜圖(正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=1∶1∶1∶2)Fig.1 HSCCC chromatogram(n-hexane∶ethyl acetate∶methyl∶water=1∶1∶1∶2)

采用溶劑系統為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶1∶1∶2，v/v)，上相為固定相，下相為流動相;流速2.0 mL/min;轉速900 rpm;進樣量75 mg的條件進行分離，結果固定相保留率為71%，分離時間為180 min，根據HSCCC圖譜(圖1)手動分段收集得到五個組分(Ⅰ-Ⅴ)，分別減壓濃縮干燥，稱重分別為25.2、2.1、7.4、29.1和3.6 mg。

3.3 HPLC分析

采用2.3中HPLC條件對桑枝待分離樣品及組分Ⅰ-Ⅴ分別進行檢測(圖2)。由圖可知，組分Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ有顯著的單一峰現象出現，用面積歸一化法得到組分Ⅰ和Ⅳ的峰純度為97%，組分Ⅲ的峰純度為90%(重結晶后純度為95%)，組分Ⅴ的峰純度為87%，組分Ⅱ中峰比較多，后分段接收該部分也沒有得到純峰，故暫時不考慮該組分。

圖2 待分離樣品及其HSCCC分離后五個組分的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of the sample under HSCCC separation and its five fractions

3.4 結構鑒定

將HSCCC分離得到的組分Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ進行理化性質和MS、1H和13C NMR等的檢測，各組數據和結果如下：

組分Ⅰ：淡黃色無定形粉末(MeOH)，在聚酰胺薄膜上顯藍色熒光，與FeCl3試劑反應呈紫色，推測可能為酚類化合物。APCI-MS m/z：243［MH］-;1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：9.58(1H，s，OH-2)，9.40(1H，s，OH-4)，9.15(2H，s，OH-3'，5')，7.34(1H，d，J=8.4 Hz，H-6)，7.14(1H，d，J=16.8 Hz，H-α)，6.76(1H，d，J=16.4 Hz，H-β)，6.33(3H，br s，H-2'，4'，6')，6.23(1H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H-5)，6.07(1H，t，J=1.8 Hz，H-3);13C NMR(DMSO-d6，100 MHz)δ：158.5(s，C-3'，5')，158.1(s，C-4)，156.0(s，C-2)，140.0(s，C-1')，127.1(d，C-6)，124.6(d，C-β)，123.2(d，C-α)，115.2(s，C-1)，107.2(d，C-5)，104.0(d，C-2'，6')，102.5(d，C-4')，101.3(d，C-3)。以上數據與文獻［7，8］報道的氧化白藜蘆醇的光譜數據基本一致，故確認化合物分子式為C14H12O4，且 H-α和 H-β的耦合常數 J=16.4 Hz，表明兩個氫為反式構型，所以確定該化合物為反式氧化白藜蘆醇(trans-oxyresveratrol)，化學結構式見圖3。

組分Ⅲ：淡黃色無定形粉末(MeOH)，在聚酰胺薄膜上顯淺藍色熒光，與FeCl3試劑反應呈紫色，推測可能為酚類化合物。APCI-MS m/z：227［MH］-;1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：9.56(1H，s，OH-4)，9.20(2H，br s，OH-3'，5')，7.35(2H，d，J= 8.6 Hz，H-2，6)，6.97(1H，d，J=16.2 Hz，H-α)，6.78(1H，d，J=16.2 Hz，H-β)，6.72(2H，d，J=8.6 Hz，H-3，5)，6.35(2H，d，J=2.0 Hz，H-2'，6')，6.13 (1H，d，J=2.0 Hz，H-4');13C NMR(DMSO-d6，100 MHz)δ：158.2(s，C-3'，5')，157.4(s，C-4)，139.1 (s，C-1')，128.2(d，C-β)，127.9(d，C-2，6)，127.4 (s，C-1)，125.6(d，C-α)，117.1(d，C-3，5)，104.9 (d，C-2'，6')，102.5(d，C-4')。以上數據與文獻［8］報道的白藜蘆醇的光譜數據基本一致，故確認化合物分子式為C14H12O3，且H-α和H-β的耦合常數J =16.4 Hz，表明兩個氫為反式構型，所以確定該化合物為反式白藜蘆醇(trans-resveratrol)，化學結構式見圖3。

組分Ⅳ：黃色無定形粉末(MeOH)，在聚酰胺薄膜上顯藍色熒光，與FeCl3試劑反應呈紫色，推測可能為酚類化合物。APCI-MS m/z：241［MH］-;1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：9.59(1H，s，OH-6)，9.46(2H，br s，OH-3'，5')，7.38(1H，d，J= 8.0 Hz，H-4)，7.08(1H，br s，H-7)，6.92(1H，s，H-3)，6.74(1H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H-5)，6.68(2H，d，J=2.0 Hz，H-2'，6')，6.21(1H，t，J=2.0，H-4');13C NMR(DMSO-d6，100 MHz)δ：158.8(s，C-3'，5')，155.7(s，C-7a)，155.2(s，C-6)，153.9(s，C-2)，131.6(s，C-1')，121.1(d，C-4)，120.7(d，C-3a)，112.4(d，C-5)，102.6(d，C-3)，102.2(d，C-2'，6')，101.5(d，C-4')，97.4(d，C-7)。以上數據與文獻［7］報道的桑辛素M的光譜數據一致，故確認分子式為C14H10O4，該化合物為桑辛素M(moracin M)，化學結構式見圖3。

圖3 三種酚類化合物的化學結構Fig.3 Chemical structures of three phenol compounds

組分Ⅴ：淺黃色無定形粉末(MeOH)，在聚酰胺薄膜上顯淡藍色熒光，與FeCl3試劑反應呈紫色，表明可能為酚類化合物。另經反式白藜蘆醇365 nm照射實驗推測該化合物可能為順式白藜蘆醇(cisresveratrol)，圖4為反式白藜蘆醇在365 nm下照射10 min后的HPLC圖譜，其新生成物質的保留時間與組分Ⅴ的基本一致，且紫外掃描圖也與組分Ⅴ及文獻報道的順式白藜蘆醇的光譜圖一致［9］。因該組分量太少且純度較低，不利于純化，故沒有進行MS、1H和13C NMR的檢測。

圖4 反式白藜蘆醇在365 nm照射后的HPLC圖譜Fig.4 HPLC chromatography of trans-resveratrol after exposure to 365 nm ray

4 小結

以往對桑枝成分的分離多采用傳統的柱色譜法，硅膠，Sephadex LH-20及RP-18等多種填料的色譜柱反復交互使用，不僅操作繁瑣，而且文獻中往往沒有體現柱色譜分離的具體參數，他人無法重現其實驗。而HSCCC操作簡單，周期短，不需要任何固態載體，避免了不可逆吸附，且分離條件及相關參數明確，保證了良好的重現性，且用該法分離得到的高純度酚類化合物可作為對照品用于桑枝的質量控制研究。

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Separation of Phenols from Ramulus mori.by High-Speed Counter-Current Chromatography

LUO Jun1，2，SUN Pei-wen1，2，LIU Shao1，2*，LI Xin-zhong1，2*1Department of Pharmacy，Xiangya Hospital，Central South University，Changsha 410008，China;2School of Pharmacy，Central South University，Changsha 410010，China

A new method was developed for the separation and purification of phenols by high-speed counter-current chromatography(HSCCC)from extract of Ramulus mori.The separation condition was determined as follows：n-hexane：ethyl acetate：methyl：water(1∶1∶1∶2，v/v)as the solvent system，the upper phase as the stationary phase，the lower phase as the mobile phase，2.0 mL/min of flow-rate，900 rpm of rotation speed，and 75 mg of injection amout.Transoxyresveratrol(25.2 mg)，trans-resveratrol(7.4 mg)，and moracin M(29.1 mg)were obtained and identified by HPLC，MS，1H and13C NMR.It indicated that HSCCC can be used for separating the active compounds of Ramulus mori efficiently and exhibited many advantages compared with the column chromatography method.

HSCCC;Ramulus mori.;phenols;oxyresveratro1;resveratrol;moracin M

1001-6880(2012)04-0486-04

2010-10-11 接受日期：2011-03-07

*通訊作者 Tel：86-731-84327454;E-mail：Xylixin@medmail.com.cn; liushao999@hotmail.com

R284.2

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