鳳尾草抗衰老作用研究

汪 燕， 邵建兵， 嚴小萍

(江蘇省如皋市人民醫院藥劑科， 江蘇 如皋 226500)

鳳尾草為鳳尾蕨科植物鳳尾草(Pteris multifida Poir)的全草或根，具有清熱解毒、涼血止血、消腫解毒等功效，民間用于治療肝炎、菌痢、淋濁、便血、扁桃體炎、癰腫瘡毒、濕疹等［1］。現代藥理研究表明，鳳尾草含黃酮類、萜類化合物、甾醇類、揮發油、苯丙素類等成分，具有廣譜抗菌、抗腫瘤、抗病毒、抗氧自由基作用［2，3］。本文以衰老的自由基學說和免疫學說作為理論依據，分析探討鳳尾草抗衰老的作用及其機制，為鳳尾草的開發和利用提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 儀器:電子天平(BP221S，德國賽博尼斯);勻漿器(IKA T10，IKA公司);渦旋儀(XW－80A，上海滬西分析儀器廠);臺式離心機(SiGMA 1－13，美國SiGMA公司);迅達半自動生化儀(C－82，上海迅達醫療儀器有限公司)。

1.2 試劑與動物:鳳尾草(江蘇九泰醫藥集團);D－半乳糖(D－Galactose)(國藥集團化學試劑有限公司);一氧化氮(NO)試劑盒(硝酸還原法)、一氧化氮合酶(NOS)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。清潔級昆明種小鼠70只，雄性，體重20±1g，江蘇大學動物實驗中心(合格證號:蘇動質95040)。

2 實驗方法

2.1 鳳尾草醇提物灌胃液制備:準確稱取20g鳳尾草粉末(過40目篩)，置燒瓶中，加入450m L70%乙醇，室溫下浸泡12h后，超聲提取30min，抽濾，殘渣再超聲提取一次，合并兩次濾液，濃縮烘干，得到鳳尾草醇提物，臨用前取提取物加水配制成9mg/mL混懸液灌胃。

2.2 造模與分組:小鼠隨機分為空白對照組(B)、衰老模型組(m)、鳳尾草醇提物低劑量組(g1)，中劑量組(g2)，高劑量組(g3)。分組后即進行衰老模型制備:模型組和各給藥組頸部皮下注射D－半乳糖200mg·kg－1·d－1，空白對照組頸部皮下注射等量生理鹽水，30d后，從空白對照組與模型組各取10只小鼠，頸脫椎處死，測定各項指標［4］，確定造模成功后，給藥組按81mg·kg－1·d－1，108mg·kg－1·d－1，135mg·kg－1·d－1分別灌胃給藥，模型對照組和空白組灌胃生理鹽水10mL·kg－1·d－1，15d 后處死所有小鼠，分取腦、胸腺和脾臟，測定各項指標，按下式計算臟器系數:臟器系數=(臟器重量/小鼠重量)×100%。

2.3 小鼠腦組織中一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)含量測定:飼養45d后動物脫頸椎處死，取腦，生理鹽水沖洗，拭干。精確稱取腦組織，加9倍體積氯化鈉溶液，勻漿，制取10%的腦組織勻漿待測。按照NO硝酸還原酶法試劑盒說明配制各試劑，540nm處測吸光度。同樣處理標本，按照NOS測試盒(測總NOS)說明配制各試劑，530nm測吸光度。

2.4 統計學處理:采用Graph Pad軟件(Prism 5，version 5.01)進行方差分析。

表1 小鼠脾臟和胸腺系數的變化

3 實驗結果

3.1 鳳尾草醇提物對小鼠免疫器官的影響:結果如表1所示，與空白組相比，模型組小鼠胸腺和脾臟系數變化均具統計學意義，表明該衰老小鼠模型體現免疫器官的變化。與空白對照組(b)相比，衰老模型組(m)胸腺指數和脾臟指數明顯降低，免疫器官代償性增重;與衰老模型組比較，模型給藥組能顯著提高脾臟指數，且呈現劑量關系。

從各組小鼠的胸腺、脾免疫器官的變化可以看出，D－半乳糖致衰老模型小鼠胸腺、脾免疫器官較空白組小鼠胸腺、脾免疫器官明顯萎縮，而鳳尾草具有增加衰老小鼠胸腺和脾的重量，提升免疫功能的作用。

3.2 鳳尾草醇提物對小鼠腦組織中NO含量的影響:結果見圖1，與正常對照組相比，衰老模型組小鼠腦組織中NO含量明顯提高;給藥組小鼠腦組織中NO含量顯著低于衰老模型組;各給藥組NO含量與空白組NO含量無顯著差異(P＞0.05);給藥組NO含量呈劑量關系。表明鳳尾草可以顯著對抗小鼠腦組織氧自由基NO，從而起到延緩小鼠衰老的作用。

圖1:給藥小鼠腦組織中NO含量bvsm，p＜0.05;mvsg1、mvsg2 及mvsg3，P均小于0.05

3.3 鳳尾草醇提物對小鼠腦組織中NOS活力的影響:結果如圖2所示，與正常對照組(b)相比，衰老模型組(m)小鼠腦組織中NOS活性顯著升高;各給藥組小鼠腦組織中NOS活性顯著低于衰老模型組;各模型給藥組小鼠腦組織中NOS活性與空白組(b)無顯著差異，說明鳳尾草可能通過降低NOS活力對延緩小鼠衰老起作用，

圖2:給藥小鼠腦組織中NOS活力bvsm，P＜0.05;mvsg1、mvsg2及mvsg3，P均小于0.05

4 討論

4.1 D－半乳糖衰老模型是目前較多用的一種人工催老模型，具有衰老變化明顯、模型穩定、耗時短等特點。D－半乳糖造成衰老模型是因代謝過程中機體產生大量自由基，其表現為多種抗氧化酶活性下降，引起小鼠的腦老化效應［5］，并在多種器官、組織的形態及生理、生化的許多觀測指標上，均呈現出與自然衰老相似的改變［6］。

4.2 NO參與調節神經系統、心血管系統及呼吸消化系統的功能和介導免疫應答等諸多生理和病理過程，是體內重要的信使分子和神經遞質，與腦部學習及記憶密切相關;同時又是一種極不穩定的強氧化劑，過量的NO則會作為強氧化劑與超氧陰離子發生反應，產生細胞毒性更強的過氧化硝基基團，對細胞產生毒性從而導致衰老的發生［7］。NOS是NO產生的關鍵酶，研究表明，較低劑量的硝普鈉(Sodium Nitroprusside)能在體內自發性釋放出NO，能使大鼠學習成績提高。而NOS阻斷劑則使其學習成績下降;較高劑量的硝普鈉也可使學習成績降低，說明適量的NO可促進學習能力，而過量的NO釋放則具有神經毒性［8］。Cutler等研究了12種靈長類和兩種嚙齒類動物肝、腦和血漿等組織中的抗氧化性物質，比較了這些動物的最大壽命與抗氧化能力間的關系，結果表明，機體自由基生成量越少，抗氧化力(清除能力)越強，最大壽命就越大。氧自由基是衰老的決定因素，在衰老進程中起著至關重要的作用。因此，如能減少自由基生成和增強機體抗自由基能力、有效維持二者之間的動態平衡，必定會有延緩衰老、促進健康的作用［9］。

4.3 NO化學性質活潑，半衰期很短，在體內很快就代謝轉為 NO2－和 NO3－，而 NO2－又進一步轉化為 NO3－，采用硝酸還原酶法可特異性地將 NO3－還原為NO2－，NO2－與Griess試劑發生重氮反應生成粉紅色化合物，通過顯色深淺利用分光光度計在540nm處檢測其吸光度，吸光度與其濃度的高低呈正比。NOS催化LArg和分子氧反應生成NO，NO與親核性物質生成有色化合物，在530nm波長處測定吸光度，根據吸光度的大小可計算出NOS活力。

4.4 衰老的免疫學說認為，胸腺是免疫系統的中樞器官，其衰退則T細胞減少，免疫殺傷力明顯降低，T細胞調控B細胞分泌抗體功能下降，產生自身免疫、T細胞分泌白細胞介素的能力下降，吞噬細胞能力和分泌干擾素的能力下降，整體免疫功能下降，導致免疫防御能力低下，易受感染、病變和衰老。脾臟中有T淋巴細胞和B淋巴細胞，還有巨噬細胞，與體液免疫、細胞免疫均有密切關系，一些免疫增強劑可使胸腺和脾臟增重［6］。本實驗結果顯示，模型給藥組胸腺和脾的重量與對照組接近，無顯著性差異(P＞0.05)，表明鳳尾草醇提物對胸腺和脾的功能狀態的良性影響，可改善機體的免疫功能。

4.5 本實驗研究表明，不同劑量的鳳尾草醇提物均可以對抗小鼠腦組織氧自由基NO，從而起到延緩小鼠衰老的作用，并呈現一定的劑量效應，綜上所述，鳳尾草醇提物抗衰老作用的機制可能有:①通過對抗小鼠腦組織氧自由基NO、抑制NOS活性、清除自由基NO，阻斷自由基鏈鎖反應，降低NO含量，發揮抗衰老作用。②鳳尾草醇提物通過對胸腺和脾臟等免疫器官功能狀態的改善，提高機體的免疫能力，增強機體的抗衰老作用。

［1］ 江蘇新醫學院.中藥大辭典上冊［M］.上海:上海科學技術出版社，1993.487.

［2］ 余有貴，趙良忠，段林東，等.鳳尾草抗菌藥物的提取與開發研究［J］.邵陽高等專科學校學報，2001，(3):199－203.

［3］ T.C.Wang，M.C.Ti，S.C.Lo，et al.Free radical－scavenging activity of aqueous extract of pteris multifida poiret［J］.Fitoterapia，2007，(78):248－249.

［4］ 龔國清，徐本.小鼠衰老模型研究［J］.中國藥科大學學報，1991，22(2):101－103.

［5］ 李文彬，韋豐，范明，等.D－半乳糖在小鼠誘導的擬老化效應［J］.中國藥學與毒理學雜志，1995，9(2):94－95.

［6］ 李笑萍，俞培先，趙東.D－半乳糖衰老模型的新指標［J］.中國現代應用藥學雜志，2004，21(6):443.

［7］ 馬厚勛，曾凡榮，曾昭淳.NO生物學作用及其與衰老的關系［J］.國外醫學老年醫學分冊，1999，20(4):169.

［8］ 劉勇林，李晨旭，邱學才.腦內NO對大鼠學習功能的影響［J］.北京醫科大學學報，1996，28:306.

［9］ 李素云，王立芹，鄭稼琳，等.自由基與衰老的研究進展［J］.中國老年學雜志，2007，27(10):2046－2048.