不同產地對九節菖蒲中總皂苷、齊墩果酸及腺苷含量的影響＊

白吉慶，王小平，盛 艷，李雙俊

(1.陜西中醫學院，陜西 咸陽 712046; 2.陜西省洛南縣科學技術局，陜西 商洛 726100)

九節菖蒲為毛茛科植物阿爾泰銀蓮花 Anemone altaica Fisch.ext C.A.Mey.的干燥根莖，又名節菖蒲、小菖蒲、京玄參、菊形雙瓶梅等，具有開竅化痰、醒脾安神功效，主要用于熱病神昏、癲癇、神經官能癥、耳鳴耳[1]，主產于河南、山西、陜西、甘肅和內蒙古等地[2－3]。九節菖蒲在《藥物出產辨》和《中國藥物標本圖影》中均被視為石菖蒲的偽品，而在1963年版和1977年版《中國藥典(一部)》以及《中藥材手冊》《中藥大辭典》《中藥志》等均以正品收載[3]。九節菖蒲主要含有琥珀酸、棕櫚酸、5－羥基－4－氧化戊酸、β－谷甾醇、銀蓮花素(白頭翁素)、蔗糖、皂苷[4－6]等。筆者建立了九節菖蒲中總皂苷、腺苷和齊墩果酸的含量測定方法，為其質量標準研究奠定基礎。

1 儀器與試藥

UV－2100型紫外－可見分光光度計(上海天美科學儀器有限公司);日立L－2400型高效液相色譜儀(UV檢測器、L－2130泵、EZStant色譜工作站);Sartorius電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司，精度0.01mg);SB－3200D型超聲儀(上海新芝生物技術研究所)等。齊墩果酸對照品(批號為110709－200304)、腺苷對照品(批號為110879－200202)，均由中國藥品生物制品檢定所提供;九節菖蒲經鑒定為毛茛科銀蓮花屬植物阿爾泰銀蓮花 Anemone altaica Fisch.ext C.A.May.的根莖，流動相所用乙腈為色譜純，甲醇、乙醇等均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

齊墩果酸:色譜柱為 Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為乙腈－水(92 ∶8);流速為 1.0 mL/min;檢測波長為208 nm;柱溫為室溫;進樣量為10 μL。腺苷:色譜柱為Diamonsil C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相為乙腈－水(8 ∶92);流速為1.0 mL/min;檢測波長為260 nm;柱溫為室溫;進樣量為10 μL。

2.2 溶液制備

精密稱取干燥至恒重的腺苷對照品適量，加甲醇使溶解，制成每1 mL含腺苷0.034 mg的腺苷對照品溶液。精密稱取干燥至恒重的齊墩果酸對照品適量，加流動相使溶解，制成每1 mL含齊墩果酸0.045 mg的齊墩果酸對照品溶液。取九節菖蒲粉末1 g，精密稱定，置100 mL燒瓶中，加100 mL 95%乙醇，回流1 h，過濾，濾液水浴揮干，殘渣用甲醇溶液，置5 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液A(用于腺苷、齊墩果酸含量測定)。取九節菖蒲粉末0.5 g，精密稱定，置100 mL燒瓶中，加40 mL 95%乙醇，回流1 h，過濾，濾液置50 mL容量瓶中，加95%乙醇至刻度，搖勻，精密吸取適量，置10 mL量瓶中，加95%乙醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液B(用于總皂苷含量測定)。

2.3 方法學考察

線性關系考察[7]:精密稱取齊墩果酸對照品適量，加95%乙醇制成每 1 mL 含 2 mg 的溶液。精密吸取該溶液 0，0.8，1.6，2.4，3.2，4 mL，置具塞試管中，依次加入新配制的80 g/L香蘭素乙醇溶液0.5 mL，體積分數為72%的硫酸溶液5 mL，搖勻，于90℃恒溫水浴上加熱10 min，立即取出并于冰水浴中冷卻15 min，取出，冷卻至室溫。以相應試劑為空白，在530 nm波長處測定吸光度，以吸光度對質量濃度線性回歸。精密吸取腺苷對照品溶液1.25，2.50，3.75，5.00，6.25 mL，分別置 10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，各取10 μL注入液相色譜儀，按2.1項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，以峰面積對質量濃度線性回歸。精密吸取齊墩果酸對照品溶液 1.0，2.5，5.0，7.5，10.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，各取10 μL注入液相色譜儀，按2.1項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，以峰面積對質量濃度線性回歸。得回歸方程 Y總=8.735 7 X+0.000 6(R2=0.999 3，Y腺=2e+08X+15 544(R2=0.999 9)，Y齊=2e+08X－19 604(R2=0.999 9)。

精密度試驗:精密吸取齊墩果酸(2 g/L)對照品溶液，依法測定其吸光度，連續測定5次，其吸光度的 SR為1.4%。分別精密吸取齊墩果酸(0.045 g/L)、腺苷(0.034 g/L)對照品溶液 10 μL，按上述色譜條件進行測定，連續進樣5次。結果齊墩果酸、腺苷峰面積的 RSD分別為0.4%和0.5%，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗:取同一供試品溶液，依法測定總皂苷含量，分別在 0，0.5，1，3，5 h 不同時間點進行檢測，其吸光度的 SR為1.7%，表明供試品溶液在5 h內穩定。取同一供試品溶液10 μL，分別在 0，1，2，6，12 h注入液相色譜儀，測定腺苷的峰面積值，其含量的 RSD為0.6%，表明供試品溶液12 h內穩定性良好。取同一供試品溶液 10 μL，分別在 0，1，2，5，10 h 注入液相色譜儀，測定齊墩果酸的峰面積值，其含量的 RSD為0.7%，表明供試品溶液在10 h內穩定性良好。

重現性試驗:取同一樣品5份，依法制備供試品溶液，分別測定其吸光度，測定齊墩果酸、腺苷的峰面積值，其含量的 RSD分別為1.6%，0.4%，1.6%，表明本試驗方法重現性良好。

加樣回收試驗:精密稱取已知總皂苷含量的樣品6份，精密加入一定量齊墩果酸對照品，依法測定其吸光度;精密稱取已知腺苷含量的樣品6份，精密加入一定量腺苷對照品，依法制備供試品溶液，取10 μL注入液相色譜儀，測定腺苷的峰面積值;精密稱取已知齊墩果酸含量的樣品6份，精密加入一定量齊墩果酸對照品，依法制備供試品溶液，取10 μL注入液相色譜儀，測定齊墩果酸的峰面積值，計算其回收率。結果見表1。

2.4 樣品含量測定

取九節菖蒲樣品，按2.2項下方法制備供試品溶液，顯色后，依法在530 nm波長處測定吸光度，按2.1項下的色譜條件測定，記錄腺苷、齊墩果酸的峰面積，代入標準曲線方程，計算總皂苷、腺苷、齊墩果酸的含量。結果見表2。

表1 加樣回收試驗結果(n=6)

表2 樣品含量測定結果(n=3)

3 討論

取適量對照品溶液和供試品溶液，置具塞試管中，依次加入新配制的80 g/L香蘭素乙醇溶液0.5 mL，體積分數為72%的硫酸溶液5 mL，搖勻，于90℃恒溫水浴上加熱10 min，立即取出并于冰水浴中冷卻15 min，取出，冷卻至室溫。在400～700 nm波長范圍內進行掃描。結果在530 nm波長處有最大吸收，故選取530 nm波長為測定波長。取適量對照品和供試品溶液，在200～400 nm波長范圍內進行掃描，結果齊墩果酸在208 nm波長處有最大吸收，腺苷在260 nm波長處有最大吸收，故分別以此作為其檢測波長。通過對多種流動相的組成、檢測波長、柱溫進行分析比較，發現采用2.1項下的色譜條件能使色譜圖的基線平直、峰形較好，且待測成分的分離度均大于1.5。

本研究中建立了九節菖蒲主要化學成分的高效液相色譜定量分析方法，方法專屬性強，定量精密度高，穩定性和重現性好，可為九節菖蒲質量標準的研究奠定基礎。

對供試品溶液制備方法進行比較，結果表明，回流提取法所得總皂苷、齊墩果酸、腺苷含量最高，超聲提取法最低，因此采用回流提取法處理樣品。

[1]中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:人民衛生出版社，1978:13－14.

[2]江蘇新醫學院.中藥大辭典[M].上海:上海科學技術出版社，2005:46－47.

[3]國家中醫藥管理局《中華本草》編委會.中華本草(上冊)[M].上海:上海科學技術出版社，1998:505－507.

[4]李婷婷，路 芳，楊秀東.九節營蒲研究進展[J].長春中醫藥大學學報，2006，22(3):68－69.

[5]鄒忠杰，楊峻山.九節營蒲化學成分研究[J].中藥材，2008，31(1):49－51.

[6]肖輝軍.石營蒲與九節營蒲的鑒別使用[J].北京中醫藥，2011，30(1):56－57.

[7]魯湘鄂.崗梅根中總皂苷的提取工藝研究[J].中國藥業，2010，19(22):54－55.