吡格列酮對糖尿病大鼠腎臟TIMP-1、TGF-β1和PDGF-β表達的影響

熊盛池 謝 燕▲ 熊 利

1.四川省涼山彝族自治州第一人民醫院內分泌科，四川西昌 615000；2.四川省喜德縣兩河口中心衛生院內科，四川喜德 615000

吡格列酮為噻唑烷二酮類降糖藥，其作用機制是高選擇性地激動過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ），PPAR-γ的活化可調節許多控制葡萄糖及脂類代謝的胰島素相關基因的轉錄，具有降糖、抗炎、改善脂質代謝、抑制細胞生長因子、降低尿蛋白排泄、增加胰島素敏感性等重要作用。本研究以吡格列酮干預糖尿病（diabetic mellitus，DM）大鼠腎臟基質金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMP1）、轉化生長因子（TGF-β1）和血小板衍生生長因子β（PDGF-β）的表達，以觀察其對糖尿病大鼠腎臟保護的作用機制，為臨床對糖尿病腎病的治療提出良好的參考資料。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 動物 6～8周齡、體重180～200 g的健康雄性SD清潔級大鼠70只，全部購自重慶醫科大學動物實驗中心，許可證號SYXK（渝）2004008。

1.1.2 試劑 厄貝沙坦（杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司，J20030113）；吡格列酮（北京太陽藥業有限公司，H20040267） ；PDGF-β兔多克隆抗體，購自武漢博士德生物工程有限公司；TIMP-1試劑盒，購自北京中杉生物技術有限公司；TGF-β1試劑盒，購自北京中杉生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備 按參考文獻[1]稍加修改建立模型。取SD大鼠60只禁食12 h后，按60 mg/kg左下腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ），制造DM大鼠模型。實驗期間給予足夠的飲水，造模4 h后腹腔注射20%的葡萄糖3～5 mL，避免低血糖死亡，72 h后大鼠尾尖取血測空腹血糖，血糖≥16.0 mmol/L確定為DM成模大鼠。將成模大鼠隨機抽樣分成4組：吡格列酮組、模型組、吡格列酮+厄貝沙坦組、厄貝沙坦組各14只。同時取10只正常大鼠作為正常對照，腹腔注射等劑量無菌檸檬酸鈉緩沖液，后在尾尖取血測血糖，血糖均在4.0～8.0 mmol/L。上述方法造模7 d后，吡格列酮組按15 mg/（kg·d）配以3～5 mL蒸餾水灌胃；厄貝沙坦組按50 mg/（kg·d）配以同等量蒸餾水灌胃；吡格列酮+厄貝沙坦組分別給予吡格列酮 15 mg/（kg·d）和厄貝沙坦50 mg/（kg·d）配以同等量蒸餾水灌胃，每日早晨8點～9點灌胃1次，模型組和正常對照組大鼠每日同一時間給予等量蒸餾水灌胃。對血糖≥20.0 mmol/L可能危及生存的大鼠皮下注射諾和靈N 2～3 U以防糖尿病酮癥酸中毒死亡。大鼠自由飲水、進食，室溫18～20℃，濕度60% ～70%，上述方法喂養12 周。

1.2.2 取材與固定 所有大鼠在喂養12周后空腹稱重量，以3%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射進行麻醉，腹主動脈取血以備行腎功能等生化檢查，后剖腹分離雙側腎臟，每側腎臟各取1/2腎組織放入4%多聚甲醛液固定保存24 h后脫水，石蠟包埋，切片，每片厚5 μm，行蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）和免疫組織化學檢測。其余腎臟標本用液氮冷凍保存，準備免疫蛋白印跡（Western blotting）等檢測。

1.3 主要觀察指標

（1）一般情況觀察；（2）腎臟病理檢查：處死大鼠時，肉眼觀察腎臟外觀情況，腎組織行HE染色；（3）腎組織TIMP-1，TGF-β1免疫組化染色（三步法）；（4）Western blotting檢測糖尿病大鼠腎組織PDGF-β蛋白。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 一般情況觀察

DM大鼠均出現多尿、煩渴、多飲、體重減輕等糖尿病表現，部分大鼠有視力下降、皮膚潰爛和感染并發癥。模型組癥狀及并發癥最明顯，實驗期間有4只死亡；正常組無死亡大鼠，其余各組癥狀輕微，實驗期間僅有2 只死亡，厄貝沙坦組和吡格列酮組各死亡1只。

2.2 各組大鼠腎臟組織病理學的特點

HE染色見模型組大鼠腎小球毛細血管基底膜增厚，系膜區有基底膜基質沉積，出現毛細血管袢折疊和融合，毛細血管阻塞。吡格列酮組、厄貝沙坦組和吡格列酮+厄貝沙坦組僅有毛細管基底膜增厚，系膜區有基底膜基質沉積，且明顯輕于模型組。正常對照組大鼠腎組織結構無明顯異常。見圖1。

2.3 各組大鼠TIMP-1的表達

TIMP-1陽性染色主要位于腎小球毛細血管基底膜、系膜區、腎小管基底膜及毛細血管袢處。正常對照組大鼠腎小球毛細血管基底膜、系膜區、腎小管基底膜上皮細胞及毛細血管袢處僅有微弱表達，見圖2。定量分析顯示，模型組TIMP-1上述部位表達顯著多于正常對照組，吡格列酮組、厄貝沙坦組和吡格列酮+厄貝沙坦組TIMP-1表達顯著少于模型組，吡格列酮組+厄貝沙坦組表達減少較吡格列酮組和厄貝沙坦組更為明顯，差異均有統計學意義（P＜0.05），不過上述部位表達均多于正常對照組；吡格列酮組與厄貝沙坦組之間差異無統計學意義（P＞0.05） 。

圖1 A-E 各組大鼠腎臟HE染色（×200）

圖2 A-E 各組大鼠腎臟免疫組化TIMP-1的表達（×200）

2.4 各組大鼠TGF-β1表達

糖尿病大鼠與正常對照組大鼠比較，前者腎小球臟層上皮細胞、毛細血管基底膜及系膜區腎小球上皮細胞、腎小管基底膜及及毛細血管袢TGF-β1均有明顯表達，后者TGF-β1主要在腎小球臟層上皮細胞、毛細血管基底膜及系膜區有微弱表達。見圖3。定量分析顯示，模型組TGF-β1表達顯著多于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；厄貝沙坦組、吡格列酮組和吡格列酮+厄貝沙坦組TGF-β1表達顯著少于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）；吡格列酮+厄貝沙坦組TGF-β1表達顯著少于吡格列酮組和厄貝沙坦，差異有統計學意義（P＜0.05），不過上述部位表達仍然多于正常對照組；厄貝沙坦組與吡格列酮組TGF-β1表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1 。

圖3 A-E 各組大鼠腎臟免疫組化TGF-β1的表達（×200）

表1 12周后各組大鼠腎臟組織TIMP-1和TGF-β1的表達（±s）

表1 12周后各組大鼠腎臟組織TIMP-1和TGF-β1的表達（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與厄貝沙坦組比較，#P＜0.01；與吡格列酮+厄貝沙坦組比較，&P＜0.05

組別 n TIMP-1 TGF-β1正常對照組 10 0.072±0.016 0.057±0.016模型組 11 0.201±0.013* 0.195±0.016*吡格列酮組 12 0.148±0.014*△& 0.131±0.020*△&厄貝沙坦組 12 0.142±0.022*△ 0.129±0.021*△吡格列酮+厄貝沙坦組 12 0.112±0.015*△# 0.102±0.015 *△#

2.5 各組大鼠PDGF-β表達

Western blotting檢測技術顯示，模型組大鼠腎組織PDGF-β表達顯著多于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；正常對照組腎組織PDGF-β僅有微弱表達，厄貝沙坦組、吡格列酮組、吡格列酮+厄貝沙坦組PDGF-β表達顯著少于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）；吡格列酮+厄貝沙坦組PDGF-β表達少于厄貝沙坦組、吡格列酮組，而多于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；吡格列酮組與厄貝沙坦組PDGF-β表達比較，差異無明顯統計學意義（P＞0.05）。見圖4、表2。

圖4 各組大鼠腎臟Western blotting PDGF-β的表達（依次為厄貝沙坦組，糖尿病模型組，吡格列酮組+厄貝沙坦組，吡格列酮組，正常對照組）

表2 12周后各組大鼠腎臟組織PDGF-β的表達（±s）

表2 12周后各組大鼠腎臟組織PDGF-β的表達（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與厄貝沙坦組比較，#P＜0.01；與吡格列酮組比較，&P＜0.05

組別 n 腎PDGF-β正常對照組 10 63 542±1 245模型組 10 136 453±1 756*吡格列酮組 10 96 428±1 603*△厄貝沙坦組 10 97 439±1 667*△吡格列酮+厄貝沙坦組 10 84 539±1 167*△&#

3 討論

TGF-β1是促纖維化最重要的因子之一，通過刺激細胞外基質的產生[2]，抑制蛋白酶和膠原酶，減少基質的降解，使細胞外基質在腎臟大量沉積，進一步發展為腎組織纖維化。腎纖維化是細胞外基質過度沉積所致，但膠原的降解減少也是重要原因。細胞外基質由基質金屬蛋白酶（MMPs）及其抑制因子TIMPs調節，前者的作用是降解膠原，而后者的作用恰恰是對抗MMPs，導致膠原的降解減少。所以增加MMPs或減少TIMP-1在腎組織的表達，均可使細胞外基質減少。因此TIMP-1對腎纖維化的形成有不容忽視的重要地位[3]。PDGF是一種潛在的促有絲分裂的細胞因子，主要分布于增生的毛細血管內皮細胞、成纖維細胞和增生的腎小球細胞。一旦受到病理刺激，特別是糖尿病的長期刺激，PDGF就在上述部位過度表達，促進系膜細胞增生和細胞基質沉積，進而引起腎纖維化，最終糖尿病腎病一步一步形成，以致終末期腎病，腎衰竭。實驗表明糖尿病大鼠腎小球PDGF-β和PDGF-β受體表達均增加[4]，PDGF-β鏈m RNA在糖尿病腎病小鼠腎組織中表達明顯上調[5]。本研究中糖尿病大鼠腎組織PDGF-β表達增多，進一步肯定了這一研究。

近年來，隨著羅格列酮爭議不斷，甚至于2010年9月23日已被FDA叫停，為了避免醫患糾紛，大部分醫務人員已經明顯的減少了對該藥的使用。吡格列酮為噻唑烷二酮類降糖藥，藥效肯定，價格低廉，在臨床上廣泛運用，不失為羅格列酮的絕佳替代品，最近的研究表明低劑量的吡格列酮長期治療，可以顯著改善糖尿病腎病患者的腎小球硬化和腎小管間質纖維化，延緩腎功能的惡化[6]，達到治療的目的。而這些作用均與吡格列酮的抗氧化、抗炎、抑制細胞生長因子、降低尿蛋白排泄率作用密切相關。吡格列酮已經被證實可以降低甘油三酯、增加高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）而調節脂質代謝，從機制上有可能延緩動脈粥樣硬化的形成[7]。大量研究表明吡格列酮可以減少TGF-β1在腎小球和腎小管的表達[8]。同時吡格列酮可以減少TIMP-l在糖尿病大鼠心肌組織的表達，通過抑制心肌纖維化的形成來實現[9]，就機制來說均是對組織纖維化的抑制，那么對腎組織纖維化的影響是不是一樣的呢？本實驗進一步肯定了這一論點。研究表明吡格列酮能減少或抑制PDGF-β在DM大鼠的腎小球和腎小管的表達，進而上調MMP-2的表達，抑制腎成纖維細胞IV型膠原的合成[10]，改善高糖狀態下的腎小球和腎小管間質的纖維化，調節腎組織細胞外基質的合成和降解，延緩糖尿病腎損害的進展，發揮腎臟保護作用。

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