NDRG1與Hpa在肝癌中的表達及與肝癌浸潤轉移的關系

高峰 楊季紅 劉渤 劉玉英 馬芳

肝癌是世界范圍內高發腫瘤，因其侵襲轉移性強而成為臨床治療的難點，因此尋找肝癌治療中的靶分子指標顯得尤為重要。近年NDRG1基因表達與腫瘤生物學特性的關系備受關注，有研究發現NDRG1在肝細胞癌、結腸癌［1，2］等多種人類腫瘤中高表達，據此認為NDRG1作為癌基因參與并促進了腫瘤發生發展過程。但也有相反觀點認為NDRG1是一種與細胞分化程度呈正相關的抑癌基因［3］。乙酰肝素酶(Hpa)是一種在多種惡性腫瘤中高表達且與腫瘤侵襲轉移有極高相關性的葡萄糖醛酸內切酶［4］。關于NDRG1和Hpa異常表達與肝癌侵襲轉移關系的研究文獻未見報道，本研究應用免疫組織化學方法聯合檢測NDRG1和Hpa在肝癌中的表達，探討二者在肝癌侵襲、轉移中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究中46例經病理證實的肝癌組織和12例肝血管瘤等正常肝組織取自本院2007年7月至2011年6月手術切除標本，所有患者術前均未經過放、化療及免疫治療。46例肝癌患者中，男30例，女16例;年齡28～69歲，平均年齡46歲;按照Edmonson病理學分級，Ⅰ、Ⅱ級26例，Ⅲ、Ⅳ級20例。癌旁組織均取自距腫瘤邊緣1～2 cm的非肝癌組織。正常肝組織為同期手術治療的肝臟良性疾病，其中肝血管瘤4例，肝囊腫3例，肝外傷5例。標本經10%甲醛溶液固定，石蠟包埋保存。

1.2 主要試劑 羊抗人NDRG1(N-19)多克隆抗體為美國Santa Cruz公司產品，兔抗人Hpa多克隆抗體為美國LAB VISION公司產品，PV-9003、PV-9001超敏即用型二步法(非生物素)檢測試劑盒為美國GBI公司產品，濃縮型二氨基聯苯胺(DAB)試劑盒等購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 免疫組織化學染色 將石蠟組織塊以4 μm厚度連續切片，分別做HE和免疫組織化學染色，常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化;3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶15 min。NDRG1抗原修復采用檸檬酸抗原修復液(0.01 mol/L，pH=6.0)、高壓熱修復。Hpa行磷酸鹽緩沖液(PBS)微波修復抗原。分別滴加羊抗人NDRG1(N-19)多克隆抗體(1∶100)，兔抗人Hpa多克隆抗體(1∶50)，4℃過夜。滴加二步法檢測試劑(按照說明書操作)，DAB顯色。PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性組織作為陽性對照。

1.4 免疫組織化學結果判斷 NDRG1陽性染色位于細胞質和(或)細胞膜，Hpa陽性染色主要分布于細胞質。二者陽性信號均為黃-棕黃色顆粒，小片狀或彌漫性分布。高倍鏡下隨機觀察10個視野，每個視野計數100個細胞，按照陽性細胞所占百分比與著色強度采用雙評分半定量法進行評分。(1)陽性細胞所占百分比評分標準:陽性細胞＜25%為0分，25% ～50%為1分，51% ～75%為2分，＞75%為3分。(2)著色強度評分標準:不著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。取(1)(2)項評分相加，0～1分為陰性(－)，2分為弱陽性(+)，3～4分為陽性(++)，5～6分為強陽性(+++)。

1.5 統計學分析 應用SPSS 12.0統計軟件，應用Wilcoxon秩和檢驗對NDRG1，Hpa在肝癌組織、癌旁組織及正常肝組織中的表達結果進行分析，應用Spearman等級相關檢驗對NDRG1，Hpa表達之間及與臨床病理指標的相關性進行分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NDRG1與Hpa在肝癌、癌旁及正常肝組織中的表達

NDRG1與Hpa蛋白在肝癌組織中的表達水平顯著高于其對應的癌旁組織及正常肝組織(P＜0.01);NDRG1與Hpa蛋白在癌旁組織和正常肝組織中的表達差異無統計學意義(P＞0.05)。見表 1，圖 1、2。

圖1 肝癌組織中NDRG1蛋白的表達(SP×400)

圖2 肝癌組織中Hpa蛋白的表達(SP×400)

表1 NDRG1和Hpa在肝癌、癌旁、正常肝組織中的表達例

2.2 NDRG1與Hpa的表達與肝癌臨床病理特征的關系

NDRG1蛋白表達水平與門靜脈有無癌栓，肝內或淋巴結轉移間差異有統計學意義(P＜0.05)。HPA蛋白表達水平與腫瘤大小、有無肝內或淋巴轉移以及肝癌組織分化程度間差異有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 NDRG1與HPA在肝癌組織中的表達與肝癌臨床病理因素的關系 例

2.3 NDRG1與Hpa在肝癌組織中表達的相關性 在HCC組織中NDRG1與Hpa的表達呈正相關(r=0.617，P＜0.01)。見表3。

表3 HCC組織中NDRG1和HPA的關系 例

3 討論

NDRG家族是近年才被逐漸發現的一族與細胞分化相關的新基因［5］。NDRG1最初是在小鼠胚胎組織中發現的，因受N-myc的抑制而得名，該基因與腫瘤發生發展的關系密切，但其對腫瘤是否具有抑制或促進作用仍存在爭論［2，6，7］。以往關于NDRG1在腫瘤組織中表達情況的研究主要集中在前列腺癌、結直腸癌及腦膠質瘤等，且研究結果有較大差異［3］。最初研究發現，NDRG1在前列腺癌、結腸癌中低表達，而在體外誘導分化的結腸癌細胞中高表達，因而推斷其可能是一種與細胞分化程度呈正相關的抑癌基因［3］。但 Koshiji等［2］研究顯示NDRG1在結直腸癌中表達明顯增加，視不同種族結直腸癌患者，NDRG1蛋白表達和組織病理類型、Duke’s分級、淋巴管或靜脈浸潤等臨床病理特征明顯相關。另有報道，NDRG1蛋白在惡性黑色素瘤、腦瘤、腎癌、肺癌等多種惡性腫瘤組織中高表達，而在正常組織中低表達，認為可以把NDRG1蛋白作為一種新的檢測惡性腫瘤的標志物［8］。檢索文獻，關于NDRG1基因與肝細胞癌的關系的研究報道較少。何靜等［9］檢測了NDRG1在肝癌和配對的癌旁組織、正常肝組織、人胎肝組織及胚胎各組織、發育不同時期小鼠肝和以及多種細胞系中的表達譜，結果表明NDRG1在正常肝組織和癌旁組織中表達量顯著低于肝癌組織中的表達量，而正常肝組織和癌旁組織表達量差異不明顯，NDRG1的表達量隨人胎肝和嬰鼠肝的逐漸發育而增高，至已達分化的成年肝又轉而降低，提示NDRG1可能是一種在細胞分化的一定階段呈高表達的與細胞分化相關的基因。本研究結果表明，NDRG1蛋白在肝癌組織中的表達顯著高于其癌旁組織及正常肝組織(P＜0.01)，這與何靜等［9］的研究結果相一致，另外還發現，NDRG1蛋白表達水平與門靜脈有無癌栓，肝內或淋巴結轉移差異有統計學意義(P＜0.05)。這些結果提示NDRG1可能作為潛在的癌基因在肝細胞癌的發生及其演進中起一定作用。有研究發現缺氧條件可誘導NDRG1基因在腫瘤組織中的高表達［10］，故而認為NDRG1在腫瘤組織中高表達可能與實體腫瘤組織缺氧有關，但確切機制尚待繼續研究。

乙酰肝素酶(Hpa)是近年較受關注的具有促腫瘤作用的內源性糖苷酶，通過對細胞外基質中硫酸肝素蛋白多糖側鏈的切割作用，促進腫瘤細胞的浸潤和轉移，還可以促進腫瘤細胞分裂、趨化、微血管形成。人類結腸癌的早期可以檢測到Hpa mRNA和蛋白聚集，而隨著病變進展(重度不典型增生-高分化腺癌-低分化腺癌)Hpa水平逐漸增高，而在鄰近正常組織無表達［11］。研究發現，HPA在肝細胞癌中高表達，并與腫瘤的侵襲和轉移密切相關［12］。Chen等［13］對120例原發性肝癌的研究發現，Hpa在腫瘤組織中顯著高表達，且與TNM分期、腫瘤大小、門靜脈癌栓或腫瘤發生轉移相關。本研究中，Hpa蛋白在肝癌組織中的表達水平顯著高于其對應的癌旁組織及正常肝組織，在癌旁組織和正常肝組織中的表達差異無顯著性。肝內和淋巴結轉移均是反映腫瘤侵襲性的指標，本研究還發現HPA的表達與腫瘤的大小和肝內或淋巴結轉移存在相關，提示HPA對肝癌的浸潤轉移有重要的促進作用。本研究還發現HPA與肝癌組織的分化程度相關，低分化的肝癌組織存在更高的HPA表達強度，說明HPA在肝癌的病程演進中起著一定作用。門靜脈癌栓亦能反映腫瘤的外侵能力，但在本研究中未發現HPA的表達與門靜脈癌栓相關，這與Chen等［13］的報道存在差異，可能與樣本例數偏少有關，尚有待于增加樣本量進一步研究。

綜上所述，NDRG1、HPA在肝細胞癌組織中高表達，提示二者可能共同參與肝細胞癌的侵襲和轉移，聯合檢測NDRG1、HPA有助于判斷肝細胞癌的轉移潛能和患者的預后，并可能為肝細胞癌的治療提供新的分子靶點和策略。

1 Chua MS，Sun H，Cheung ST，et al.Overexpression of NDRG1 is an indicator of poor prognosis in hepatocellular carcinoma.Mod Pathol，2007，20:76-83.

2 Koshiji M，Kumamoto K，Morimura K，et al.Correlation of N-myc downstream-regulated gene1 expression with clinical outcomes of colorectal cancer patients of different race/ethnicity.World J Gastroenterol，2007，13:2803-2810.

3 Guan RJ，Ford HL，Fu Y，et al.Drg-1 as a differentiation-related，putative metastatic suppressor gene in human colon cancer.Cancer Res，2000，60:749-755.

4 Ikeguchi M，Hirooka Y，Kaibara N.Heparanase gene expression and its correlation with spontaneous apoptosis in heparanase of cirrhotic liver and carcinoma.European Journal of Cancer，2003，39:86-90.

5 Shimono A，Okuda T，Kondoh H.N-myc-dependent repression of ndr1，a gene identified by direct subtraction of whole mouse embryo cDNAs between wild type and N-myc mutant.Mechan Dev，1999，83:39-52.

6 Dang C，Gottschling M，Manning K，et al.Identification of dysregulated genes in cutaneous squamous cell carcinoma.Oncol Rep，2006，16:513.

7 王震，王芳，魏萬里.NDRG1基因在結直腸癌發生發展過程中的表達及其與淋巴結轉移的關系.中華病理學雜志，2004，33:264.

8 Cangul H，Salnikow K，Yee H，et al.Enhanced expression of a novel protein in human cancer cells:a potential aid to cancer diagnosis.Cell Biol Toxicol，2002，18:87-96.

9 何靜，周柔麗.NDRG1基因與肝組織分化及癌變的相關性.北京大學學報(醫學版)，2003，35:471.

10 Chen B，Nelson DM，Sadovsky Y.N-myc down-regulated gene 1 modulates the response of the human trophoblasts to hypoxic injury.Bio Chem，2006，281:2764-2772.

11 Friedmann Y，Vlodavsky I，Aingom H，et al Expression of heparanase in normol dysplastic and neoplastic human colon mucosa and stroma.Am J Pathol，2000，157:1167.

12 王順祥，吳曉慧，周少英，等.乙酰肝素酶反義硫代寡脫氧核苷酸對人肝癌細胞系侵襲力的抑制作用.基礎醫學與臨床，2006，26:62-66.

13 Chen G，Dang YW，Luo DZ，et al.Expression of heparanase in hepatocellular carcinoma has pro-gnostic significance:a tissue microarray study.OncolRes，2008，17:183.