足細胞相關蛋白對糖尿病腎病的影響

李思佳，劉育軍

(1.上海中醫藥大學，上海 200062；2.上海中醫藥大學附屬普陀醫院 腎內科,上海 200062)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)微血管并發證之一，其發病率及病死率均較高，其確切發病機制尚未完全闡明。美國的一項研究表明，病程超過25年的DM患者約有25%～40%的DM發生DN，而約有40%的ESRD是因糖尿病腎病引起的[1]。DN最顯著的臨床特征是尿蛋白排泄增加，從微量白蛋白排泄增多漸進發展至大量蛋白尿，而蛋白尿又是加重腎損害的危險因素之一。蛋白尿的發生與腎小球濾過屏障的結構和功能改變有著密切的關系。 足細胞是附著在腎小球基底膜外的高度分化的細胞,它與GBM、腎小球內皮細胞共同構成了腎小球濾過屏障,近年來研究[2]證明足細胞損傷在糖尿病腎病發生發展過程中起著重要作用。隨著對足細胞的深入研究，發現足細胞裂孔隔膜上有與腎小球濾過屏障功能及蛋白尿發生密切相關的重要物質，這些足細胞相關蛋白對糖尿病發生發展有著密切聯系。

1 足細胞生理結構和功能

腎小球臟層上皮細胞(glomerular visceral epithelialcel1)又稱足細胞(Podocyte)，是一種終末分化多突狀細胞,可分為結構和功能不同的3部分，即細胞體、主突和足突。細胞體和主突分布于腎小球囊腔側并通過足突與腎小球基底膜相連。足突分頂部、基底部及裂隙隔膜(Slit diaphragm，SD)。足突是足細胞的標志性特征，通過α3β1整合素復合體和α-β-蛋白聚糖復合體連接于腎小球基底膜上[3]。Dalla Vestra等[4]對白種人Ⅱ型DM患者的研究也發現有腎小球足細胞密度和數量減少、足突寬度增加等改變，且尿白蛋白排泄率(UAER)與足細胞密度呈反相關，與足突寬度呈正相關；足細胞還可發生肥大、變性，進而從GBM上脫落、丟失，致使硬化腎小球的GBM廣泛裸露，持續性損傷將導致足細胞凋亡，最終進展終末期腎功能衰竭[5]。

2 足細胞相關蛋白分子對DN的影響

2.1 Nephrin Nephrin是跨膜蛋白的蛋白,它是免疫球蛋白超家族的一種含1 241個殘基的細胞黏附分子，被認為是SD拉鏈狀結構的一部分，分子量為135KD。在其c端富含絲氨酸和酪氨酸殘基。它與配體結合時，某些酪氨酸殘基發生磷酸化而介導細胞間的信號傳遞。有研究[7]報道，新生小鼠足細胞開始分化、裂孔隙隔膜形成初期就有nephrin表達。

Nephrin與足細胞胞漿內的ZO-1、肌動蛋白等緊密連接并與細胞骨架相關蛋白相互作用以維持足細胞的正常形態和功能，其基因和(或)蛋白表達異常在蛋白尿的發生機制中有重要作用。對糖尿病患者研究[8]發現，高糖環境下腎小球足細胞Nephrin表達減少，尿蛋白排泄增加，提示DN發病可能與Nnphrin表達下調而增加GBM通透性和基質沉積有關。Forbes JM等[9]的動物模型也發現DN早期nephrin mRNA表達增加，尿中出現nephrin蛋白，后期nephrin mRNA表達逐漸下降，由此推測DN早期nephrin mRNA表達增加是對nephrin蛋白從尿中丟失的代償性變化。

足細胞nephrin表達減少可能通過下述途徑致糖尿病腎病進展及尿白蛋白排泄率增加:1)相鄰足突裂孔隔膜分子篩結構破壞，失去腎小球選擇性濾過最后屏障。2)肌動蛋白細胞骨架的重排和足突的消失。3)nephrin-CD2AP-podocin復合體是足細胞抗凋亡信號的關鍵[10]。

2.2 Podocin Podocin是繼nephrin之后新近發現的一種蛋白因子，分子量42KD,存在于裂孔膜上呈發夾樣結構，插入細胞膜，折疊處位于膜表面。體內外研究[11]證實podocin羧基末端與nephrin胞內段羧基末端及CD2AP相互作用形成蛋白復合體，介導SD與足細胞骨架相連，增強nephrin信號傳導。同時Kawachi[12]研究還發現podocin和nephrin可能具有親和性，蛋白尿時，二者的表達都呈下降趨勢，進一步證明二者變化部位幾乎相同，從而推測二者的協同表達是維持SD通透性的重要因素。

在同時研究podocin和nephrin在DN中表達變化的實驗中,Wu Yc等[13]對DN大鼠通過Westernblot等方法研究發現腎小球足細胞中podocin和nephrin蛋白的表達明顯降低。

2.3 CD2AP CD2AP是一種分子量約80kD，富含SH3(Srchomolog 3)結構的連接蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員。其主要功能是通過其在T細胞與抗原提呈細胞間的特異性連接中表達，結合CD2黏附分子胞質區，將其與細胞骨架相連，促進T細胞與抗原呈遞細胞的黏附，從而使抗原呈遞得以進行。CD2AP在足細胞中的功能主要是與nephrin及podocin結合參與足細胞信號轉導。研究[14]已證實CD2AP的C末端功能區與Nephrin的胞漿末端結合，在Nephrin和肌動蛋白細胞骨架間起橋梁作用。palmen等[15]通過免疫共沉淀試驗發現，CD2AP可經其羧基端的第3個SH3結構域和nephrin直接發生相互作用。

Iyengar等[16]應用連鎖分析未發現212例有家族史的糖尿病腎病患者的發病與CD2AP相關，Benigni等[17]的研究中發現DN患者中nephrin的表達明顯降低，而podocin和CD2AP的表達沒有明顯的變化，并且認為nephrin的表達降低和podocin、CD2AP的正常表達可能是DN的特征之一。

2.4 a-actinin-4 a-actinin-4是一種足細胞骨架蛋白，足細胞骨架支撐足細胞的細胞體、主突和足突，在維持足細胞正常形態和功能上發揮著重要作用。a-actinin-4分子是一種actinin微絲交聯蛋白，可將松散的肌動蛋白交聯成具有收縮能力的纖維束，對于錨定纖維束至胞漿膜具有輔助作用。在足細胞中以Nephrin、Podocin、CD2AP為中心組成的裂隙膈膜復合體也直接或間接地與a-actinin-4 相聯系[18]。它的基因突變可引起的遺傳性家族性局灶節段性腎小球硬化(FSGS)即表現為足細胞足突融合消失和SD結構破壞[19]。

Kimura M等[20]對17例糖尿病腎病患者腎組織通過原位雜交和免疫組化，發現a-actinin-4 mRNA和蛋白表達均明顯降低。Ha.TS[21]在體外研究發現，高糖與糖基化終末產物(AGEs)聯合干預下，足細胞a-actinin-4的表達下調，導致DN腎小球足細胞骨架破壞。有研究表明，a-actinin-4表達改變可能是造成足突融合以致發生蛋白尿的原因[22]。

2.5 ZO-1 ZO-1是一個225KD鳥氨酸激酶家族的緊密連接蛋白,位于SD插入足突處的胞質側，主要表達在足突上，能和actin 細胞骨架相互作用，將SD蛋白連接至肌動蛋白細胞骨架上，對穩定足突結構非常重要[23]。Fukasawa等[24]研究認為，裂孔隔膜上存在緊密連接蛋白(JAM)，可緊密連接足突和GBM，使其不易從GBM上脫落。ZO-1可能通過酪氨酸磷酸化參與信號轉導，其分布異常和酪氨酸磷酸化可能與nephrin同源蛋白NEPH1羧基端最后3個氨基酸結合和相互作用，導致細胞內骨架與足突重排，從而引起足細胞形態結構與功能的改變，導致蛋白尿的發生[25]。

Rincon-Choles H等[26]通過免疫組化和WesternWesternblot對Ⅰ型和Ⅱ型DN小鼠模型的研究表明，裂孔膜上的ZO-1在糖尿病小鼠的腎小球上表達減少，ZO-1可從足細胞膜上重新分布到細胞質中,提示ZO-1濃度和位置的改變可能與DN蛋白尿的發病機制有關。Macconi D等[27]在血管緊張素Ⅱ干預了的足細胞的實驗研究中發現了ZO-1重分布和選擇通透性障礙,并以此推測ZO-1的分布及表達改變在蛋白尿的發生機制中發揮作用。

2.6 podocalyxin 足細胞頂膜區一重要成分即podocalyxin。Podocalyxin是一種CD34相關的跨膜糖蛋白，富含唾液酸，在足細胞表面形成多聚糖蛋白復合物是腎小球濾過膜負電荷屏障的主要組成成分。podocalyxin表面電荷具有抗黏附作用，可以防止帶負電荷的蛋白分子從裂孔隔膜中漏入原尿中，podocalyxin蛋白的正常表達是保證腎小球濾過膜電荷屏障的基礎，能夠抵制相鄰足突間及其與基質間的黏附，維持其獨特的形態結構[28]。

Koop K等[29]在有蛋白尿的腎小球疾病(局灶節段性腎小球硬化、微小病變、糖尿病腎病、IgA腎病等)患者的腎活檢組織中發現腎小球podocalyxin蛋白表達低于正常對照組；Nakaln T等[30]研究發現隨著DN病程由微量蛋白尿到大量蛋白尿的形成，足細胞在尿中的檢測也有顯著差異性，通過應用podocalyxin抗體檢測尿中足細胞數量可以作為預測DN嚴重性和指導治療的一種指標。

3 小結與展望

近年來的研究都已經證實在糖尿病腎病發生、發展過程中，足細胞在其中起著關鍵的作用。在高血糖、TGF-β和血管緊張素Ⅱ等致病因素作用下,足細胞裂孔隔膜蛋白、細胞骨架蛋白及細胞骨架與裂孔隔膜之間緊密連接蛋白和頂膜區蛋白表達的改變，繼而出現足突融合，足細胞從基底膜上脫離，腎小球濾過屏障通透性增高等結構改變，促進局灶節段性腎小球硬化的發生，腎功能下降，出現蛋白尿。因此研究足細胞相關蛋白分子的表達改變及相應的逆轉措施可為糖尿病腎病早期防治帶來新的希望。目前對足細胞相關蛋白分子對DN及蛋白尿影響的研究還有許多不完善之處，值得進一步探索研究。

[1]Collins AJ,Kasiske B,Herzog C,et al.Excerpts from the United States Renal Data System 2006 Annual Data Report[J].Am J Kidney Dis,2007,49(1 Suppl 1):A6-7,S1.

[2]Marshall SM.The podocyte:a potential therapeutic target in diabetic nephropathy current[J]. pharmaceutical design,2007,13:2713-2720.

[3]陶花,顧樂怡.足細胞骨架相關蛋白的調節及其在細胞生物學中的作用[J].中國中西醫結合腎病雜志,2011,12(7):641-645.

[4]Dalla Vestra M,Masiero A,Roiter AM,et al.Is podocyte injury relevant in diabetic nephropathy? Studies in patients with type 2 diabetes[J].Diabetes,2003,52(4):1031-1035.

[5]李琴,龔偉.足細胞骨架結構的調節機制與蛋白尿[J].腎臟病與透析腎移植雜志,2011,20(2):149-153.

[6]Mundel P,Shankland SJ.Podocyte biology and response to injury[J].J Am Soc Nephrol,2002,13(12):3005-3015.

[7]Pavenstdt H,Kr Z,Kretzler M,et al.C biology 0f the glomerular podocyte[J].Physiol Rev,2003,83(1):253-307.

[8]Doublier S,Salvidio G,Lupia E,et al.Nephrin expression is reduced in human diabetic nephropathy:evidence for a distinct role for glycated albumin and angiotensin Ⅱ[J].Diabetes,2003,52(4):1023-1030.

[9]Forbes JM,Bonnet F,Russo LM,et al.Modulation of nephrin in the diabetic kidney:association with systemic hypertension and increasing albuminuria[J].J Hypertens,2002,20(5):985-992.

[10]Huber TB,Hartleben B,Kim J,et al.Nephrin and CD2AP associate with phosphoinositide 3-OH kinase and stimulate AKT-dependent signaling[J].Mol Cell Biol,2003,23(14):4917-4928.

[11]牛霞,鹿玲.Podocin蛋白對腎小球足細胞的影響[J].現代生物醫學進展,2007,7(6):863-864,848.

[12]KawachiH,KoikeH,KuriharaH,et al.Cloning of rat homolugue of ppdocin:expressionin proteinuric statesan din developing glomerular[J].J Am Soc Nephrol,2003,14(1):46-56.

[13]Wu YG,Jing D,Liang Y,et al.Nephrin and podocin loss is prevented by mycophenolate mofetil in early[J].Cytokine,2008,44(1):85-91.

[14]Shaw AS,Miner JH.CD2-associated protein and the kidney[J].Curr Opin Nephrol Hypertens,2001,10(1):19-22.

[15]Palmén T,Lehtonen S,Ora A,et al.Interaction of endogenous nephrin and CD2-associated protein in mouse epithelial M-1 cell line[J].J Am Soc Nephrol,2002,13(7):1766-1772.

[16]Iyengar SK,Fox KA,Schachere M,et al.Linkage analysis of candidate loci for end-stage renal disease due to diabetic nephropathy[J].J Am Soc Nephrol,2003,14(7 Suppl 2):S195-S201.

[17]Benigni A,Gagliardini E,Tomasoni S,et al.Selective impairment of gene expression and assembly of nephrin in human diabetic nephropathy[J].Kidney Int,2004,65(6):2193-2200.

[18]Lehtonen S,Zhao F,Lehtonen E.CD2-associated protein directly interacts with the actin cytoskeleton[J].Am J Physiol Renal Physiol,2002,283(4):734-743.

[19]Kaplan JM,Kim SH,North KN,et al.Mutations in ACTN4,encoding alpha-actinin-4,cause familial focal segmental glomerulosclerosis[J].Biochem Biophys Res Commun,2000,267(3):906-911.

[20]Kimura M,Toyoda M,Kato M,et al.Expression of alpha-actinin-4 in human diabetic nephropathy[J].Intern Med,2008,47(12):1099-1106.

[21]Ha TS.High glucose and advanced glycosylated end-products affect the expression of alpha-actinin-4 in glomerular epithelial cells[J].Nephrology (Carlton),2006,11(5):435-441.

[22]Kos CH,Le TC,Sinha S,et al.Mice deficient in alpha-actinin-4 have severe glomerular disease[J].J Clin Invest,2003,111(11):1683-1690.

[23]González-Mariscal L,Betanzos A,Avila-Flores A.MAGUK proteins:structure and role in the tight junction[J].Semin Cell Dev Biol,2000,11(4):315-324.

[24]Fukasawa H,Bornheimer S,Kudlicka K,et al.Slit diaphragms contain tight junction proteins[J].J Am Soc Nephrol,2009,20(7):1491-1503.

[25]Huber TB,Schmidts M,Gerke P,et al.The carboxyl terminus of Neph family members binds to the PDZ domain protein zonula occludens-1[J].J Biol Chem,2003,278(15):13417-13421.

[26]Rincon-Choles H,Vasylyeva TL,Pergola PE,et al.ZO-1 expression and phosphorylation in diabetic nephropathy[J].Diabetes,2006,55(4):894-900.

[27]Macconi D,Abbate M,Morigi M,et al.Permselective dysfunction of podocyte-podocyte contact upon angiotensin Ⅱ unravels the molecular target for renoprotective intervention[J].Am J Pathol,2006,168(4):1073-1085.

[28]Takeda T,Go WY,Orlando RA,et al.Expression of podocalyxin inhibits cell-cell adhesion and modifies junctional properties in Madin-Darby canine kidney cells[J].Mol Biol Cell,2000,11(9):3219-3232.

[29]Koop K,Eikmans M,Baelde HJ,et al.Expression of podocyte-associated molecules in acquired human kidney diseases[J].J Am Soc Nephrol,2003,14(8):2063-2071.

[30]Nakamura T,Ushiyama C,Hirokawa K,et al.Effect of cerivastatin on proteinuria and urinary podocytes in patients with chronic glomerulonephritis[J].Nephrol Dial Transplant,2002,17(5):798-802.