分子標記鑒定葫蘆科瓜類作物種子純度的研究進展

劉愛群，趙麗麗，王國政，趙越

（遼寧省農科院蔬菜所，沈陽，110161）

種子在農業生產中占有極其重要的地位，是最基本的生產資料，其質量直接關系到農業生產的安全和優良品種增產潛力的發揮。種子的純度是指品種典型一致性的程度，是衡量種子質量的重要指標之一，是進行種子分級的主要依據，是保證優良品種增產潛力得以發揮的關鍵因素，也是種子品質控制中最棘手的問題。因此，開展種子純度檢測對保證種子品質和提高農業生產效益具有重要意義。

目前應用于瓜類作物比較多的種子純度檢測方法有種子形態檢測、田間種植檢測、同工酶檢測、DNA分子標記檢測。不同品種種子形態差異很大，田間種植檢測周期長，而且易受環境影響；同工酶法是檢測不同品種基因表達產物蛋白質之間的差異，多態性不夠豐富，并且受到組織和器官特異性的影響，使取材受到限制，從而較難推廣應用[1]；DNA分子標記反映了DNA水平上的生物個體間的遺傳差異，穩定性高，不受組織類別、發育階段和環境條件的影響，技術操作簡單、快速，并且在特定條件下可長期保存等，為種子純度鑒定提供了一個全新的途徑。葫蘆科瓜類作物在蔬菜和水果生產中占有重要地位，但較番茄、水稻等作物，其分子標記技術的研究還很薄弱[2，3]。本文擬就國內外瓜類蔬菜作物分子標記技術檢測種子純度的研究進展進行綜述，以期為育種工作提供理論指導。

1 RFLP技術與種子檢測

限制性片段長度多態性（RFLP）是發展最早的一種分子標記技術。其基本原理是檢測DNA片段的大小，該片段是在限制性內切酶酶切后所形成的特定的片段。同一品種個體間或不同品種間由于DNA核苷酸缺失、倒位、異位、重排等變異事件的發生，不同來源的限制性內切酶酶切位點分布不同，不同個體產生的DNA片段大小也不同。該標記穩定性強、多態性高、結果準確，不受植物生長發育階段的影響，可以在室內進行。但是，也存在一些不足，如操作繁瑣、檢測周期長、成本費用高、多態性檢出率低、探針特異性較強、DNA某些特定區域很難找到相應的RFLP標記等，這些不足限制了該技術在實踐中的應用。

Matsuura等[4]運用RFLP探針酶組合對黃瓜親本及其F1雜交種進行分析，確定可將其運用于種子純度鑒定。Neuhausen[5]對甜瓜種的遺傳多樣性進行研究，利用RFLP技術在分子水平上對44份材料進行分類，發現兩個類型分別為muskmelon和honeydew內的多態性分子標記比較少。

2 RAPD技術與種子檢測

隨機引物擴增多態性（RAPD）是Williams等[6]于1990年提出的，它以一個含10個堿基序列的核苷酸作引物，以生物基因組DNA為模板進行PCR擴增，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA序列的多態性來鑒別不同的品種。其多態性通常是某單一位點擴增產物的有無記錄，每種引物擴增的一條譜帶代表了被擴增基因組中的一個遺傳位點。RAPD技術對DNA需要量極少，且質量要求不高，操作簡單，沒有放射性物質，靈敏度強，分辨率高，成本較低，一套引物可以進行不同生物基因組的分析，可以檢測整個基因組。該技術在作物遺傳育種中廣為利用。但RAPD標記結果穩定性欠佳，并且表現為顯性遺傳，不能區分顯性純合和雜合基因型，在推廣應用上有一定局限性。

孫敏等[7]利用RAPD指紋圖譜對黃瓜種子純度進行鑒定，并建立了適用于黃瓜早青2號父本、母本以及雜交種的純度鑒定方法。孫妮等[8]對苦瓜雜種一代及其父母本的特異性進行分析，采用RAPD技術，結果引物OPU19擴增的 OPU19-1600 bp片斷在父本和F1中出現，在母本中未出現；對該一代雜種的 F2、Bl、B2代進行的遺傳分析表明，OPU19-1600 bp片斷可能與父本的某一對基因連鎖，在F2、B1、B2代中符合孟德爾一對顯性基因的分離規律，從而證實其可用于區分母本與雜交種。劉富中等[9]利用PCR程序優化，從80個隨機引物中篩選出5個可進行3個甜瓜雜交種的純度鑒定的引物，并且發現其中一條引物可同時鑒定3個甜瓜雜交種，同時建立了快速進行甜瓜RAPD分析的技術體系。李成偉等[10]利用RAPD分子標記技術在節瓜種子純度鑒定上也取得了一定進展。陳金體等[11]利用分子標記技術對11個甜瓜品種進行品種區別和種子純度鑒定，結果發現，采用優化的RAPD-PCR條件以及利用5個引物可以將11個甜瓜品種區別開來，并且還利用1個引物對銀輝甜瓜的雜交種子純度進行了鑒定。而Truska等[12]在分析了3個黃瓜親本材料的RAPD多態性后發現黃瓜多態性差，認為RAPD分析不適于驗證黃瓜雜交種的純度。

3 SSR技術與種子檢測

簡單序列重復（SSR）又稱微衛星DNA[13]，是指以少數幾個核苷酸為單位多次串聯重復的DNA序列，如（GA）n、（AC）n、（GAA）n、（GATA）n等，廣泛分布于基因組的不同位置。由于基本單元重復次數不同，而形成了SSR的多態性。SSR的多態性所依賴的基本單元重復次數的變異在生物群體中大量存在，具有高度的變異性和豐富的多態性，具有RFLP的遺傳學優點，比RAPD重復性和可信度高，且技術操作簡便，是目前遺傳標記的熱點。但是由于SSR技術需要對所研究物種的基因位點進行克隆和測序分析，設計相應的引物，需要足夠的時間、人力和物力。一旦找到了多態性較高的引物，就可表現出SSR的優越性。

張紅等[14]以2個甜瓜品種及其親本為試材，建立并優化了單粒種子DNA快速提取法和RAPD、SSR分子標記雜交種純度鑒定體系，研究發現，同RAPD相比，SSR分子標記更適合甜瓜雜交種純度的快速鑒定。艾呈祥等[15]也開展了利用SSR分子標記鑒定西瓜雜交種純度的研究，取得了可喜的進展，篩選出雜交種鑒定的引物，有些可以直接用于田間置信度檢測。

李菊芬等[16]以西瓜雜交種東方紅1號和8424及其各自親本為材料，分別利用RAPD、ISSR和SSR 3種分子標記技術對西瓜雜交種的多態性進行了分析。研究發現，RAPD和ISSR引物中，均未篩選到能區分雜交種和其親本的特異引物；而從供試的SSR引物中篩選到3對特異引物，均可有效地對雜交種東方紅1號和8424的純度進行快速鑒定，且結果與田間鑒定結果一致。張穎等[17]利用SSR分子標記技術，建立了黃瓜品種室內分子標記遺傳純度鑒定與田間純度鑒定結果的回歸關系，得到了田間純度的預測方程式，由此可利用室內遺傳純度鑒定的結果進行田間純度的預測。

4 ISSR技術與種子檢測

簡單序列重復間區（ISSR）DNA標記技術是Zietkiewicz等[18]在1994年提出的。ISSR技術的基本原理為設計出PCR引物，與真核生物基因組中存在的SSR序列相結合，對兩個距離較近、方向相反的DNA進行擴增，最后檢測其序列的多態性。大多數ISSR標記所用的PCR引物是基于動植物基因組中存在的大量雙核苷酸重復序列。其產物的多態性遠比RFLP、RAPD、SSR豐富，能夠提供更多關于基因組的信息，而且穩定性比RAPD好，試驗重復性好，符合孟德爾遺傳規律，具顯性或共顯性特點[19，20]，并且基因定位速度快，操作簡便，引物開發費用低。ISSR標記在很多分子育種領域得到了應用，有很大的發展潛力。

劉萬勃等[21]將ISSR和RAPD 2種分子標記技術相結合，對甜瓜種質資源進行遺傳多樣性的研究，首先根據2種標記的結果，將供試材料分為兩類∶野生甜瓜和栽培甜瓜。兩種分子標記的分析結果呈極顯著正相關（r=0.62＞r0.01）。各野生甜瓜種質之間的遺傳距離較大，這與其分類地位基本一致。易克等[22]也利用SSR和ISSR標記技術構建了西瓜的分子遺傳連鎖圖譜。朱巖芳等[23]對ISSR分子標記技術在植物種質資源研究中的應用進行了綜述。Behera等[24]用29個RAPD和15個ISSR引物對38份印度苦瓜進行遺傳多樣性聚類分析，結果表明，RAPD和ISSR的多態性評估是一致的，并且苦瓜栽培品種和野生材料的起源不同，因此這項研究可以為苦瓜種內遺傳分析和育種選擇提供依據。羊杏平等[25]利用RAPD和ISSR 2種分子標記對西瓜雜交種抗病蘇蜜和蘇蜜5號進行了研究，發現了能用于純度檢測的RAPD父本、母本特異性引物和ISSR母本特異性引物，并且在ISSR標記分析中很難找到父母本共顯性及父本特異標記，得出單純用ISSR標記鑒定2個F1雜交種純度是無效的結論。

5 AFLP技術與種子檢測

擴增片段長度多態性 （AFLP）是RAPD和RFLP兩種技術的結合，由Zabeau等[26]發明的一項專利技術。它將限制性酶切與PCR相結合，因此具有RFLP的可靠性和PCR技術的高效性，能夠在一個反應內檢測大量的限制性片段，為大量不同來源和不同復雜程度的基因組的分析提供便利，非常適合于遺傳圖譜的構建、種質資源分析、基因組定位與基因標記等[27～29]。但該技術對DNA的純度和內切酶的質量要求很高，技術操作步驟多、時間長，加之受到專利保護，因此，應用受到一定的限制。

翟文強等[30]利用AFLP技術對哈密瓜3個F1與其相應的親本進行分析，檢測其雜交種子的純度，研究發現可以通過指紋分析雜交種與其父、母本之間的遺傳關系，確定可以作為雜交種純度鑒定的依據。王玲平等[31]研究發現，以瓠瓜雜種一代浙蒲2號及其父、母本和品系J099為材料，運用AFLP對瓠瓜雜種進行純度鑒定，同時建立了相關的技術體系，并且從引物組合中篩選出比較好的引物，該引物可以快速鑒定浙蒲2號種子純度。

6 SRAP技術與種子檢測

相關序列擴增多態性（SRAP）又叫基于序列擴增多態性，由Li等[32]在2001年提出，是一種新型分子標記技術，它基于PCR技術，利用基因外顯子里G、C含量豐富，啟動子和內含子里A、T含量豐富的特點設計兩套引物，并且對開放閱讀框架進行擴增。此技術綜合了AFLP、RAPD、SSR等標記技術的優點，如共顯性、穩定、操作簡單、重復性強、中等產率等，能夠廣泛應用于不同蔬菜作物的基因克隆、定位，以及遺傳圖譜的構建等[33～35]。

李嚴[36]以西瓜雜交種及其親本為材料，利用25對SRAP引物對其種子進行純度鑒定，研究發現擴增結果與田間種植純度鑒定結果十分接近，表明SRAP技術具有檢驗雜交種純度的能力。王從彥等[37]采用SRAP方法，利用引物ME 3/EM7，ME 7/EM 1對西瓜HR雜交種種子純度進行鑒定，研究發現，SRAP純度鑒定結果與田間種植鑒定結果的相似率和相關性均較好，由此得出可用SRAP標記鑒定法替代田間種植鑒定法。

7 EST-SSR技術與種子檢測

EST-SSR是指基于EST序列或者位于EST序列上開發的SSR標記，也被稱為eSSR標記；另外，有人利用cDNA克隆來開發研究SSR標記，所獲得的標記被稱為cSSR標記，而傳統的利用基因組DNA開發的基因組SSR標記則被稱為gSSR標記。將SSR按照其來源分為廣義上的兩類，即ESTSSR（代表來自于轉錄區的SSR）和gSSR（代表來自于基因組上非轉錄區的SSR）。EST可用于新基因的發現、基因的表達、調控研究和基因芯片的底物等[38]。此外在種質資源的研究中也有相關的報道[39，40]。

由于這項技術是近些年剛發展起來的，因此相關的研究報道甚少。盧銳等[41]利用102對EST-SSR引物對黃瓜雜交種哈研808及其親本進行純度分析，結果發現其中有2對EST-SSR引物能夠用于黃瓜雜交種子純度的鑒定。

8 SCAR技術與種子檢測

序列特征化的擴增區域（SCAR）是由 Paran等[42]提出來的，是先將一個比較理想的RAPD標記克隆、測序，然后設計出較長的引物，將引物合成后對不同材料中RAPD標記的有無進行擴增，從而檢測DNA間的差異。該方法快捷、方便、可靠，能夠快速檢測大量個體。SCAR標記為顯性，穩定性比RAPD高，但是技術步驟多、操作周期長、所需費用較高。

許勇等[43]獲得了西瓜與抗枯萎病基因相連鎖的SCAR標記，該標記已經應用于抗病轉育F3代群體中。這是2000年國內外首次在西瓜上獲得抗病基因RAPD標記和SCAR標記，以及成功地將分子標記輔助育種技術用于西瓜抗枯萎病育種。王玲平等[44]也利用SCAR分子標記發現了瓠瓜品系J083白粉病抗性基因。

9 問題與展望

分子標記技術以其多態性高、遺傳穩定、不受環境條件限制等優勢被廣泛應用于蔬菜作物種子純度鑒定。若雙親之一具有某一性狀則可應用于F1種子純度鑒定，共顯性則為雜種，否則為假雜種。分子標記技術的出現和不斷完善，勢必為葫蘆科瓜類作物遺傳育種提供更多的選擇空間。今后種子檢測應注意以下幾個方面。

①采用分子標記鑒定葫蘆科瓜類作物種子純度的研究起步比較晚，關于這方面的報道還比較少，另外，此類作物基因組比較少，遺傳基礎狹窄，變異幅度小，篩選出多態性差異的特異引物具有一定的難度。

②不同的分子標記技術具有不同的優缺點，在實際操作中，要根據研究對象和研究目的，善于利用標記技術的優點，最好選擇2種以上分子標記方法進行檢測，并結合傳統的鑒定方法，這樣可使檢測結果更真實可靠。

③有些標記技術尚處于研究階段，還需要進一步研究和完善。同時注意那些操作簡便、穩定性好、成本低廉、安全高效的分子標記技術的開發、引入和創新。

④提高分子標記技術鑒定種子純度的工作效率，實現半自動化或者全自動化操作，但是很多儀器和設備都比較昂貴，尚存在改進之處。

⑤分子標記技術需要根據不同蔬菜類型和不同作物品種類型采用不同的鑒定方法，因此必須建立完善的蔬菜作物種子純度鑒定體系，為種子純度室內準確檢測提供依據，從而加快蔬菜產業的良好發展。

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