蔡氏扶正消癥湯聯合奧沙利鉑抑制胃癌生長的研究

王海波 蔡慎初 徐曉峰 吳式琇 黃慶科

當前我國胃癌的防治現狀是“三高三低”:發病率高、病死率高、轉移率高，早期診斷率低、手術根治率低、5年生存率低?；熥鳛橹委熚赴┲匾闹委煼绞剑貏e是對無法切除的胃癌病人中占主導地位，雖然近10年來胃癌的化療效果得到長足的進步，但至今仍無國際統一的“金標準”方案，與此同時，腫瘤耐藥、免疫抑制等因素使多數體質虛弱的患者無法按期進行化療，而中醫藥在治療胃癌上有抑瘤、調節免疫、延長帶瘤生存期、提高生存質量、減輕化療不良反應等優勢［1～3］。

蔡氏扶正消癥湯系國家級名老中醫蔡慎初教授所創。本課題組前期研究發現，蔡氏扶正消癥湯能有效抑制人胃癌SGC－7901細胞增殖［4］。本研究擬進一步探討蔡氏扶正消癥湯單獨及聯合奧沙利鉑對體內外胃癌生長的抑制作用，并初步探討其可能機制，為蔡氏扶正消癥湯的臨床應用提供一定的實驗參考。

材料與方法

1.材料:奧沙利鉑(江蘇恒瑞公司);胎牛血清、RPMI－1640培養基和含EDTA胰蛋白酶(美國Gibco公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒和CCK－8試劑盒(上海碧云天生物技術研究所);AnnexinⅤ－FITC細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物發展有限公司);Bax、Bcl－2和β－actin抗體(美國Abcam公司);免疫組化SP試劑盒(北京中山金橋公司)。

2.細胞培養:人胃癌細胞株SGC－7901購自中國科學院上海生化和細胞生物研究所。將SGC－7901細胞接種于含10%胎牛血清、100μg/ml青霉素和100μg/m l鏈霉素的RPMI－1640培養液中，置37℃、體積分數5%的CO2、飽和濕度的培養箱中培養，每2天換液1次，生長至70%～80%培養瓶面積時胰蛋白酶消化傳代。

3.實驗動物:BALB/c裸鼠40只，雄性，體重18～22g，鼠齡4～5周，溫州醫學院動物實驗中心提供，飼養于該動物實驗中心SPF屏障系統潔凈層流架內。

4.蔡氏扶正消癥湯水煎劑的制備:蔡氏扶正消癥湯由黃芪、人參、溫莪術、藤梨根、露蜂房、八月札、白毛根、徐長卿、全蝎等藥物組成。藥材經三蒸水漂洗3次，置燒杯中煎煮30min去渣，8層紗布過濾，60～80℃隔水蒸，濃縮成生藥1g/ml，并調節pH值7.0～7.2后4℃保存備用，臨用前再以3000r/min離心5min去渣。

5.CCK－8法檢測細胞增殖:收集處于對數生長期的SGC－7901細胞，在96孔培養板每孔接種4×103個細胞，過夜貼壁后分別加入25μg/ml的奧沙利鉑、20mg/ml的蔡氏扶正消癥湯生藥及兩藥聯合作用，每組6個復孔，繼續培養24 h，同時設置空白調零組(不加細胞加入等量的PBS)。按照試劑盒說明各孔加入CCK－8溶液10μl，酶標儀測各組A450值后計算細胞存活率。細胞存活率(%)=(實驗組A450值－空白調零A450值)/(對照組A450值－空白調零A450值)× 100%。

6.AnnexinⅤ－FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡:收集處于對數生長期SGC－7901細胞，藥物處理同上，按試劑盒說明用500μl Binging Buffer重懸細胞，分別加入5μl AnnexinⅤ －FITC和5μl PI后混勻，室溫下避光10 min后流式細胞儀檢測細胞早期凋亡率。

7.Western blotting檢測細胞中Bax和Bcl－2表達:25μg/ m l的奧沙利鉑、20 mg/ml的蔡氏扶正消癥湯生藥及兩藥聯合處理對數生長期的SGC－7901細胞24h后，胰酶消化，4℃下1000r/min離心5min收集細胞，加入細胞裂解液(含50mmol/ L Tris pH 8.0，150mmol/L NaCl，1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)pH 8.0，0.1%十二烷基酸鈉(SDS)，1%Triton X－100)在冰上裂解細胞30min，4℃下12000r/min離心15min，收集細胞裂解液，以Bradford比色法測定蛋白質濃度。取等量蛋白質(30微克/孔)以12%分離膠電泳分離蛋白，5%脫脂奶4℃封閉過夜后滴加兔抗人Bax和Bcl－2抗體為第一抗體，HRP標記的羊抗兔IgG為第二抗體，ECL顯色，X線膠片曝光。

8.人胃癌裸鼠移植瘤的建立和給藥方案:取5×106個對數生長期的SGC－7901細胞懸浮于0.2ml無血清1640培養基中，注射到裸鼠腋部皮下建立人胃癌裸鼠移植瘤模型，共制備40只胃癌皮下移植瘤模型，將荷瘤裸鼠隨機分為對照組、奧沙利鉑組、蔡氏扶正消癥湯組和聯合組(n=10):對照組每只裸鼠腹腔內注射生理鹽水0.2ml;蔡氏扶正消癥湯給藥采用灌胃，劑量為10g/kg體重，相當于人體給藥劑量的5倍，每日1次，連續使用30天;奧沙利鉑給藥采用腹腔內注射，劑量為5mg/kg體重，隔天給藥1次，連用7次。蔡氏扶正消癥湯給藥結束后14天，處死動物并仔細剝離腫瘤組織，稱重后計算抑瘤率。抑瘤率(%)=(1－治療組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100%

9.免疫組織化學法檢測腫瘤組織中Bax和Bcl－2表達:所有標本均經10%甲醛常規固定、石蠟包埋，5μm厚度連續切片。按照免疫組化SP試劑盒說明書進行免疫組化染色，并以PBS代替一抗作為陰性對照。高倍鏡(×400)下隨機選擇5個視野，每個視野計數200個細胞，共計數1000個細胞。結果判定標準為:無陽性細胞為陰性(－)，陽性細胞數＜10%為弱陽性(+)，10%～50%為中度陽性(++)，＞50%為強陽性(+++)。Bcl－2以細胞質或胞膜呈棕黃色顆粒為陽性，Bax蛋白以細胞質有棕黃色顆粒為陽性。

10.統計學方法:實驗所得計量數據以均數±標準差(x± s)的形式表示，應用SPSS 11.0統計軟件進行方差檢驗、秩和檢驗和t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1.蔡氏扶正消癥湯和奧沙利鉑對SGC－7901細胞增殖和凋亡的變化:25μg/m l的奧沙利鉑、20mg/m l的蔡氏扶正消癥湯生藥及兩藥聯合處理SGC－7901細胞24h后，細胞存活率分別為81.26%±10.26%、75.12%±8.95%和57.56% ±5.56%，聯合用藥組與各單藥組以及對照組相比較，均有顯著性差異(P＜0.05);蔡氏扶正消癥湯聯合奧沙利鉑作用24h誘導19.65%±2.08%的胃癌細胞發生早期凋亡，與蔡氏扶正消癥湯單藥組12.35%±1.67%和奧沙利鉑組7.77%±1.21%以及對照組2.14%±0.56%相比較，均有顯著性差異(P＜0.05)，蔡氏扶正消癥湯組和奧沙利鉑組細胞早期凋亡率均明顯高于對照組(P＜0.05)。

2.蔡氏扶正消癥湯和奧沙利鉑對SGC－7901細胞中Bax和Bcl－2表達的影響:如圖1所示，與對照組相比較，奧沙利鉑和蔡氏扶正消癥湯均可上調SGC－7901細胞中Bax的表達水平，聯合用藥組中Bax蛋白表達升高更明顯;而奧沙利鉑對SGC－7901細胞中Bcl－2表達無明顯抑制作用，但蔡氏扶正消癥湯單獨及聯合奧沙利鉑可顯著抑制SGC－7901細胞中Bcl－2蛋白的表達。

圖1 Western blotting檢測蔡氏扶正消癥湯和奧沙利鉑對胃癌SGC－7901細胞中Bax和Bcl－2蛋白表達的影響

3.奧沙利鉑和蔡氏扶正消癥湯對裸鼠胃癌皮下移植瘤生長的抑制作用:治療結束后，各組鼠重均有不同程度的降低，對照組、奧沙利鉑組、蔡氏扶正消癥湯組和聯合用藥組裸鼠體重下降分別為0.26± 0.11g、1.1±0.34g、0.35±0.06g和0.46±0.16g，聯合用藥組裸鼠體重下降明顯低于奧沙利鉑單藥組(P＜0.05);另外奧沙利鉑組裸鼠治療期間均出現不同程度腹瀉和裸鼠脫水等不良反應，但療程結束也隨之停止，而蔡氏扶正消癥湯組和聯合用藥組裸鼠的胃腸道反應則較奧沙利鉑組明顯減輕，僅30%裸鼠出現少量稀便(P＜0.05)。實驗第34天處死動物，奧沙利鉑組腫瘤平均重量為0.41±0.15g，與對照組0.78 ±0.23g相比較有統計學意義(P＜0.05)，抑瘤率為47.43%;蔡氏扶正消癥湯組腫瘤平均重量為0.70± 0.21cm3，與對照組相比較無統計學意義(P＞0.05);聯合用藥組腫瘤平均重量為0.26±0.08g，抑瘤率為66.67%，與對照組和各單藥組相比較，均有顯著性差異(P＜0.05)。

4.奧沙利鉑和蔡氏扶正消癥湯對裸鼠胃癌皮下移植瘤組織中Bax和Bcl－2表達的影響:免疫組織化學染色可見對照組中大量細胞Bcl－2呈陽性表達，少數細胞Bax呈陽性表達(圖2);與對照組相比較，奧沙利鉑組中Bax蛋白陽性表達細胞比率增加，而Bcl－2陽性表達無明顯影響;蔡氏扶正消癥湯組腫瘤組織中Bax和Bcl－2的表達相對對照組分別上調和下調;與對照組相比較，聯合用藥組中Bcl－2陽性表達細胞顯著減少，而Bax陽性表達細胞明顯增多。

圖2 免疫組織化學法檢測奧沙利鉑和蔡氏扶正消癥湯對裸鼠胃癌皮下移植瘤中Bax和Bcl－2表達的影響(×400)

討論

目前，化療是治療胃癌的主要手段之一，奧沙利鉑作為治療胃癌的一線化療藥物之一，但奧沙利鉑單獨治療胃癌的效果不理想，同時化療的不良反應較大［2］。因此尋求一種安全有效的方法增強傳統化療藥物奧沙利鉑在胃癌中的療效受到越來越多的關注。祖國傳統中醫藥在治療胃癌方面有其自身的優點:癥狀改善顯著，不良反應小，全身狀態保持較好，病情發展較慢，病人腫瘤相關指標可下降，腫瘤亦可縮小或帶瘤較長期生存［3］。因此中醫藥抗腫瘤研究成為當前研究的熱點之一。

本課題組前期研究發現，蔡氏扶正消癥湯不僅能有效抑制人胃癌SGC－7901細胞增殖，還有抑制胃癌血管生成的作用［4，5］。本研究中筆者發現蔡氏扶正消癥湯對人胃癌細胞株SGC－7901有明確的增殖抑制作用，同時流式細胞術結果表明蔡氏扶正消癥湯作用人胃癌SGC－7901細胞后誘導更多的早期凋亡細胞，從而表明蔡氏扶正消癥湯對人胃癌SGC－7901細胞生長抑制方式可能是以誘導細胞凋亡方式為主;同時本研究表明蔡氏扶正消癥湯可增強奧沙利鉑對體外胃癌細胞的增殖抑制和凋亡誘導作用。為進一步驗證蔡氏扶正消癥湯單獨及聯合奧沙利鉑對體內胃癌生長抑制作用，筆者建立裸鼠胃癌皮下移植瘤模型，體內實驗結果表明蔡氏扶正消癥湯單獨對體內胃癌皮下移植瘤無明顯生長抑制作用，考慮到中藥抗腫瘤治療起效較慢，可能與本次體內實驗時間安排過短有一定關系;但蔡氏扶正消癥湯可顯著增強奧沙利鉑對體內胃癌生長抑制作用，表明蔡氏扶正消癥湯確切的抗體內胃癌生長的療效;同時在本次體內實驗期間，奧沙利鉑表現出一定的不良反應，但蔡氏扶正消癥湯不僅對實驗動物未表現出明顯的不良反應，同時可削弱奧沙利鉑對瘤荷裸鼠的不良反應，進一步表明蔡氏扶正消癥湯在增強傳統化療藥物療效的同時，還可提高傳統化療藥物治療上的安全性，顯示出蔡氏扶正消癥湯應用于胃癌治療中的可喜前景。

鑒于目前祖國傳統中醫藥應用于惡性腫瘤治療中鮮有機制探討，本研究中，筆者探討了Bax/Bcl－2在蔡氏扶正消癥湯聯合奧沙利鉑在治療體內外胃癌中的作用。在細胞凋亡過程中，Bcl－2家族起到重要的雙重調節作用，凋亡抑制蛋白Bcl－2能阻止細胞通過線粒體通道途徑發生凋亡，而另一Bcl－2家族蛋白成員Bax能對抗凋亡抑制蛋白Bcl－2的作用，從而誘導細胞發生凋亡［6］;最新研究表明，百里醌可通過抑制Bcl－2的表達從而增強奧沙利鉑對惡性腫瘤細胞的增殖抑制作用，同時對正常細胞無明顯不良反應［7］。在本試驗中，蔡氏扶正消癥湯不僅能上調體外胃癌細胞中Bax表達水平，還能抑制Bcl－2的表達;另外蔡氏扶正消癥湯聯合奧沙利鉑后更顯著上調Bax和下調Bcl－2在胃癌細胞中的表達;同時筆者在裸鼠胃癌皮下移植瘤中也觀察到類似的結果，從而表明蔡氏扶正消癥湯能調控Bcl－2家族蛋白，從而發揮抑制體內外胃癌生長的效應。

綜上所述，在本研究首次表明，蔡氏扶正消癥湯不僅可明顯增強奧沙利鉑對體外胃癌的生長抑制作用;同時體內實驗也表明蔡氏扶正消癥湯應用于胃癌治療的安全性和有效性;蔡氏扶正消癥湯單獨或聯合奧沙利鉑還可上調Bax和下調Bcl－2在體外胃癌細胞以及體內胃癌皮下移植瘤組織中的表達。因此，筆者推斷，蔡氏扶正消癥湯可靶向調節Bax和Bcl－2在胃癌中的表達，從而誘導胃癌細胞凋亡，進而增強奧沙利鉑對體內外胃癌的抑制作用，而蔡氏扶正消癥湯聯合奧沙利鉑有望成為新的治療方案應用于臨床胃癌治療。

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2 王婧，田劭丹，陳信義.晚期胃癌治療進展［J］.中國腫瘤臨床，2010，37(3):171－175

3 孫大志，許玲，姜林娣，等.中醫藥治療胃癌臨床研究文獻質量的調查評價［J］.中國臨床醫學，2003，10(6):833－835

4 郎瑋，謝泳泳，葉人，等.扶正消癥方藥液誘導胃癌細胞凋亡的實驗研究［J］.中國中醫藥科技，2006，13(5):296－298

5 王海波，葉人，郎瑋，等.蔡氏扶正消癥湯抑制胃癌血管生成的機制研究［J］.上海中醫藥大學學報，2006，20(2):49－51

6 Su YT，Chang HL，Shyue SK，et al.Emodin induces apoptosis in human lung adenocarcinoma cells through a reactive oxygen species－dependent mitochondrial signaling pathway［J］.Biochem Pharmacol，2005，70(2):229－241

7 Banerjee S，Kaseb AO，Wang Z，et al.Antitumor activity of gemcitabine and oxaliplatin isaugmented by thymoquinone in pancreatic cancer［J］.Cancer Res，2009，69(13):5575－5583