左旋18-甲基炔諾酮對大鼠垂體黃體生成素細胞形態(tài)及血清濃度的影響

黎海莉，杜 鵑，劉雅坤，劉曉云，康 林*，崔慧先

（1.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院婦產科，河北石家莊050011；2.河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院人體解剖學教研室，河北石家莊050017）

·論 著·

左旋18-甲基炔諾酮對大鼠垂體黃體生成素細胞形態(tài)及血清濃度的影響

黎海莉1，杜 鵑2，劉雅坤1，劉曉云2，康 林2*，崔慧先2

（1.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院婦產科，河北石家莊050011；2.河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院人體解剖學教研室，河北石家莊050017）

目的分析左旋18-甲基炔諾酮（levonorgestrel，LNG）對大鼠垂體黃體生成素（luteinizing hormone，LH）細胞形態(tài)和血清濃度的影響。方法應用免疫組織化學方法結合計算機圖像分析，觀察應用LNG后大鼠垂體LH細胞的變化，同時應用自動化學發(fā)光免疫分析儀測定血清LH濃度。結果短期實驗組大鼠LH細胞形狀變圓（P＜0.05），灰度加深（P＜0.05），而細胞數量和平均面積無明顯改變（P＞0.05）；長期實驗組大鼠LH細胞形狀不規(guī)則，細胞數量和平均面積減少（P＜0.01）；短期和長期實驗組大鼠血清LH濃度均下降（P＜0.01）；停藥后LH細胞數量，平均面積及血清LH濃度逐步恢復正常（P＜0.01）。結論應用LNG可以引起大鼠垂體LH細胞形態(tài)及血清LH濃度的改變，但這一過程是可恢復的。短期應用主要作用部位在垂體前葉。長期應用同時抑制了下丘腦GnRH的合成與分泌，從而抑制排卵。

甲基炔諾酮；垂體；黃體激素類；大鼠

單純孕激素口服避孕藥，對哺乳期婦女和想使用口服形式避孕的婦女，是一種很好的避孕方法［1-2］。目前，涉及下丘腦-垂體-卵巢軸反饋調節(jié)機制的研究報道多集中于生殖藥理學、生化學與臨床研究方面［3-4］，缺乏單純孕激素避孕藥對下丘腦-垂體-卵巢軸反饋調節(jié)的形態(tài)學資料。在單純孕激素避孕藥左旋18-甲基炔諾酮（levonorgestrel，LNG）的長期作用下，大鼠下丘腦促性腺激素釋放激素（gonadotroPin-relasing hormone，GnRH）陽性神經元形態(tài)發(fā)生改變：光密度減低；棘型GnRH神經元減少，棘突觸數量減少，纖維膨體數下降，長期應用LNG，可使下丘腦GnRH神經元的功能處于非活躍狀態(tài)［5］。我們還證實下丘腦神經肽Y神經元參與了LNG長期作用下GnRH分泌的調節(jié)［6］，同時下丘腦弓狀核、下丘腦腹內側核雌激素受體也參與了這一反饋調節(jié)過程［7］。但是在垂體水平，LNG對黃體生成素（luteinizing hormone，LH）細胞形態(tài)及血清LH的影響還未見報道。本文應用免疫組織化學并結合計算機圖像分析技術對大鼠應用LNG后垂體LH細胞的形態(tài)學變化以及血清LH濃度的變化，進行了觀察、分析和初步探討，以期為臨床避孕藥物的應用提供形態(tài)學資料。

1 材料與方法

1.1 動物及分組：健康成年雌性SD大鼠36只，體質量200～250g（河北省實驗動物中心提供），自然光照、室溫（22±3）℃、自由飲食飲水飼養(yǎng)。大鼠隨機分為對照組與實驗組，實驗組大鼠分為短期實驗組7只（喂藥20d），長期實驗組7只（喂藥90d）和停藥實驗組7只（停藥后繼續(xù)普通喂養(yǎng)20d）。實驗組大鼠每天上午9時左右灌胃服用溶于食用麻油的LNG 50mg·kg-1·d-1，對照組（15只）灌服等量食用麻油。

1.2 取材及切片：依據陰道涂片結果分別將處于動情期的實驗組及其相應對照組的大鼠稱質量，心臟取血后迅速使用4%多聚甲醛經主動脈行灌流固定，靜置1h。所取心臟血樣，室溫下低速離心（2 000r/min）20min，-20℃?zhèn)溆么郎y。取垂體入Bouin液固定12h，常規(guī)脫水透明，石蠟包埋，用組織切片機從垂體頭側向尾側做冠狀連續(xù)切片，片厚4μm，切片裱于涂有多聚賴氨酸的載片上。每例垂體連續(xù)集片于10組載玻片（同一載玻片相鄰兩張切片間隔40μm）（圖1A，B），入37℃溫箱內干燥24h，備用。

1.3 免疫組織化學法：常規(guī)石蠟切片脫蠟至水、依次進入0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，PH7.4），3%過氧化氫（甲醇稀釋）常溫孵育，10%正常山羊血清、豚鼠抗大鼠β-LH單克隆抗體（協和醫(yī)科大學提供，PBS 1∶7 000稀釋），4℃冰箱過夜。生物素標記的1∶100兔抗鼠IgG（北京中山生物技術有限公司提供），37℃溫箱、濕盒內孵育30min。1∶100辣根過氧化物酶的鏈霉卵白素（北京中山生物技術有限公司提供），37℃溫箱、濕盒內孵育30min。用DAB-H2O2顯色3min，自來水停顯、脫水、透明、中性樹膠封固（圖1C，D）。

1.4 計算機圖像分析：根據大鼠垂體冠狀切面上前葉、中間葉和后葉出現的形態(tài)學特征，每只大鼠分別在垂體頭端部、中間部和尾端部選擇典型切片各1片。具體標準為，頭端部，神經葉和中間葉等寬處；中間部，神經葉最寬處；尾端部，神經葉剛消失，只剩中間葉和前葉組織處。應用ZL-2000型計算機圖像分析系統，在相應切片上分別對單位視野內（0.01mm2）LH細胞的數量及其面積，平均灰度和形狀等參數進行測定。

1.5 血清LH濃度測定：應用美國德普公司自動化學發(fā)光免疫分析儀（IMMULITE系統）及原裝試劑盒測定血清LH濃度。該方法是一種固相、雙位點、化學發(fā)光免疫測量法，固相為聚乙烯珠，包被有抗所測激素的特異性單克隆抗體，與血中激素結合后再與堿性磷酸酯多克隆抗體形成復合物，加入化學發(fā)光底物，通過溫控光度計測量光子量，應用計算機內存Master's曲線計算結果。

1.6 統計學方法：應用SAS8.0統計軟件進行分析，計量資料以±s表示，比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

垂體HE染色切片光鏡觀察，可見腺細胞排列成不規(guī)則的索和團狀，少數成濾泡狀，細胞間有豐富的竇狀毛細血管（圖1B）。大鼠腺垂體LH免疫反應陽性細胞的胞質呈淺褐色，細胞呈圓形或卵圓形，細胞核為圓形或橢圓形，常位于竇狀毛細血管附近，在大鼠垂體頭端部的腹側區(qū)，頭端部和尾端部的背側區(qū)及鄰近中間葉的兩側翼數量多（圖1D），胞體較大（圖2A）。我們應用計算機圖像分析系統，對垂體單位視野內LH細胞的數量及其面積、平均灰度和圓形度等參數進行了測定。

2.1 LNG對大鼠LH細胞面積的影響：短期實驗組LH細胞面積（149.6±16.54）μm2和停藥實驗組（151.27±33.38）μm2，與各自對照組（151.45± 18.41）μm2、（160.93±22.81）μm2相比（圖2），差異無統計學意義（P＞0.05）。長期實驗組（124.85±22.27）μm2與長期對照組（163.72± 24.97）μm2相比，細胞面積減小，差異有統計學意義（P＜0.01）。各實驗組間縱向比較，長期實驗組細胞面積最小，與短期實驗組和停藥實驗組相比差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.2 LNG對大鼠LH細胞數量的影響：單位視野內LH免疫反應陽性細胞的數量，長期實驗組（7.44± 1.21）個，少于長期對照組的（9.42±0.42）個（圖2），差異有統計學意義（P＜0.01）；停藥實驗組（8.60±0.45）個，少于停藥對照組的（9.02±0.33）個，差異有統計學意義（P＜0.05）。各實驗組間縱向比較，長期實驗組細胞數目最少，分別與短期實驗組和停藥實驗組相比，差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.3 LNG對大鼠LH細胞平均灰度的影響：短期實驗組56.83±3.63與短期對照組61.49±3.94相比，細胞灰度加深（圖2），差異有統計學意義（P＜0.05）。長期實驗組58.33±2.81和停藥實驗組60.06±3.37與各自對照組60.43±3.74、60.19± 2.27相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.4 LNG對大鼠LH細胞形狀的影響：細胞形狀用圓形度定量描述截面形態(tài)和圓的相差程度，若細胞截面為圓時，圓形度為1，當截面非圓時，圓形度＜1，界面越不規(guī)則，圓形度越小。LH細胞的圓形度，短期實驗組0.75±0.015與短期對照組0.72± 0.014相比，形狀變圓（圖2），差異有統計學意義（P＜0.01）。長期實驗組0.70±0.035與長期對照組0.71±0.015相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。停藥實驗組0.69±0.04與停藥對照組0.71±0.012相比，細胞形狀不規(guī)則，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.5 LNG對大鼠血清LH濃度的影響：短期實驗組（183.9±14.77）mU/L、長期實驗組（177.76± 9.95）mU/L與短期對照組（212.48±16.33）mU/L、長期對照組（215.42±13.80）mU/L相比，血清LH濃度下降，差異有統計學意義（P＜0.01）。停藥實驗組（204.36±14.50）mU/L與停藥對照組（209.36±9.91）mU/L相比，差異無統計學意義（P＞0.05），而與長期實驗組相比，血清LH濃度上升，差異有統計學意義（P＜0.01）。

3 討 論

正常的排卵依賴于下丘腦-垂體-卵巢軸的精密調控。其中，下丘腦分泌的GnRH對垂體的影響有2種效應。首先，GnRH能促進LH的合成與釋放。其次GnRH能在LH第2次作用于垂體前葉時，使其釋放更容易，LH峰值也明顯高于第1次［8-9］。而孕酮則可降低此反應，使LH分泌下降，這可能與孕激素降低垂體雌激素受體數目有關［7］。這種反應還同血中雌、雄激素水平有關。正常動情周期中，在促性腺激素的作用下，卵泡逐步生長、成熟，使內源性雌激素水平逐步升高。雌激素水平升高可觸發(fā)和增強GnRH對垂體的效應，并使大鼠垂體GnRH受體數量增加，從而激發(fā)LH、FSH分泌高峰，引起排卵。雄激素則表現出抑制作用，睪酮能與垂體雄激素受體結合，直接抑制LH分泌［10］。

LNG是第2代全合成孕激素類藥物，為19-去甲基-睪酮的衍生物，19位甲基被取代，17位增加乙炔基，是強有力的孕激素，并具有一定雄激素和抗雌激素活性。本實驗觀察到短期應用LNG后，圓形LH細胞明顯增多，細胞的平均灰度加深，血清LH濃度下降。這表明激素分泌減少，分泌顆粒在細胞內聚集，使細胞變圓，免疫陽性反應加強。由此可以認為，短期應用LNG后，LH細胞內仍有少量激素合成，并形成分泌顆粒。

本實驗結果顯示，長期應用LNG后，垂體LH細胞形狀不規(guī)則，細胞變小，數量減少，血清LH濃度下降。其主要原因可能是GnRH水平下降或其分泌的脈沖頻率、幅度的改變，導致LH的合成與分泌處于停滯。由于細胞質內無LH形成，LH分泌顆粒很少，甚至用較敏感的SP免疫組織化學方法也不能顯示，表現為免疫反應陽性細胞變小，數量減少。本實驗結果表明，短期應用LNG達到抑制排卵的作用是多環(huán)節(jié)的，其關鍵作用部位在垂體前葉。而長期應用LNG是抑制了下丘腦GnRH的合成與分泌［2-3］，其具體機制還需進一步研究。

本實驗觀察到，停藥后大鼠垂體LH細胞的形態(tài)、細胞的分布及大小均逐漸接近正常情況，血清LH濃度也逐步恢復正常水平。應用LNG對腺垂體細胞形態(tài)和內分泌活動的影響是暫時的，停藥后可逐漸恢復正常。LNG是一安全、高效、可逆的孕激素類避孕藥物。（本文圖見封二）

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（本文編輯：趙麗潔）

THE EFFECTS OF LEVONORGESTREL ON THE MORPHOLOGICAL CHANGE OF THE PITUITARY LH CELLS AND SERUM LH LEVEL IN RATS

LI Haili1，DU Juan2，LIU Yakun1，LIU Xiaoyun2，KANG Lin2*，CUI Huixian2
（1.Department of Obstetrics and Gynecology，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Hebei Province，Shijiazhuang 050011，China；2.Department of Anatomy，the School of Basic Medical Sciences，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）

ObjectiveTo investigate the morPhological alternations of Pituitary luteinizing hormone（LH）cells and the serum concentrations of levonorgestrel（LNG）-treated rats.MethodsThe Pituitary LH cells were identified by immunohistochemistry and comPuter images analysis system.The serum concentrations of LH were measured by IMMULITE automated analyzer.ResultsIn short-term treated grouP，the shaPe of LH cells became round（P＜0.01）and the gray level（P＜0.05）of LH cells increased，while the number and mean area of LH cells had no significant difference as comPared with that in control grouP（P＞0.05）.In long-term treated grouP，the number and mean areas of LH cells decreased（P＜0.01）and the shaPe became irregular.The serum concentrations of LH were significantly lower in treated grouP than those of control grouP in both terms（P＜0.01）.After ceasing treatment，these changed features recovered to normal gradually（P＜0.01）.ConclusionLNG caused changes of morPhology of LH cells and concentrations of LH in serum，but these changes can return to normal afterceasing treatment.The decrease of the Pituitary resPonse to GnRH caused by short-term treatment of LNG Play an imPortant role on antiovulation，while long-term effects PerhaPs also involve central mechanisms such as influence on hyPothalamus，making synthesis and release of GnRH decrease.

norgestrel；Pituitary；corPus luteum hormones；rats

R979.21

A

1007-3205（2012）05-0497-04

2012-02-02；

2012-04-05

河北省科技廳博士基金課題（04547002D-3）

黎海莉（1974-），女，河北邯鄲人，河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學博士，從事生殖內分泌學以及婦科腫瘤診治研究。

*通訊作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.05.001