離體葉綠體熒光觀察實驗的改進研究

黃國文

（湖南科技學院 生命科學和化學工程系，湖南 永州 425100）

葉綠體是植物特有的細胞器，是光合作用的場所。1931年Kaustky和Hirsch用肉眼觀察并記錄了葉綠素熒光誘導現(xiàn)象[1]。將暗適應的綠色植物或含有葉綠素的組織突然暴露在可見光下，葉綠體的熒光快速上升然后下降到一個穩(wěn)定狀態(tài)，這一現(xiàn)象稱為Kautsky效應。熒光強度隨光照時間變化的曲線稱為葉綠素熒光誘導動力學曲線。在普通生物學實驗的教學中開設了綜合性的“葉綠體的分離和熒光觀察”實驗[2]，目的是使學生了解葉綠體的制備方法和葉綠體熒光產生的機理，了解熒光強度與光合作用的關系以及葉綠體活性與熒光強度的關系，培養(yǎng)學生對生物現(xiàn)象的觀察和理解能力以及運用知識解決實際問題的能力。但是在這個實驗中對于用差速離心法制備離體葉綠體和觀察其熒光現(xiàn)象的步驟，大多數學生不能很好地和獨立地完成。本人根據這種實際情況，研究了存在這種現(xiàn)象的原因，設計了一個離體葉綠體的制備和熒光現(xiàn)象觀察的新方法—質壁分離法分離離體葉綠體并觀察其熒光。應用這種方法取得的實驗結果較好。

1 建立本方法的依據

1.1 葉綠體熒光現(xiàn)象的產生機理

當葉綠體中葉綠素分子吸收光能（光量子）后，其中的電子由低能級（基態(tài)）激發(fā)為高能電子（激發(fā)態(tài)）。不同光質激發(fā)的高能電子出現(xiàn)在不同的軌道中旋轉。如果葉綠素分子被藍光（430nm）激發(fā)，葉綠素中的電子躍遷到能量較高的軌道稱為第二單線態(tài)；如果被紅光（670 nm）激發(fā)，電子躍遷到能量較低的軌道旋轉稱為第一單線態(tài)。處于第一和第二單線態(tài)的電子，其自旋方向保持原來狀態(tài)，如果電子在激發(fā)或退激過程中自旋方向發(fā)生變化，該電子就進入能級較單線態(tài)低的軌道稱為三線態(tài)。這些高能態(tài)電子很不穩(wěn)定，經過一定時間后，其能量可以同時向三個方面轉化[3]。一種形態(tài)是第二單線態(tài)的高能電子返回第一單線態(tài)以及第一單線態(tài)和三線態(tài)的高能電子返回基態(tài)時產生熱量，第二種形態(tài)是第一單線態(tài)的高能電子會傳遞給內囊體膜上的電子傳遞鏈參與光化學反應和葉綠體基質中進行有機物合成，第三形態(tài)是第一單線態(tài)和三線態(tài)高能電子返回基態(tài)產生熒光和磷光。熒光的壽命很短，只有10-8- 10-10s。這三種能量形態(tài)以競爭的方式出現(xiàn)，以至任何一種能量形態(tài)效率的增加會導致其它兩個種能量形態(tài)產量的減少[4]。正常條件下植物捕獲的光能主要用于光化學反應，剩余的能量以熒光、熱耗散等方式被耗散掉[5]。葉綠素分子吸收藍光后躍遷到較高能級第二單線態(tài)的高能電子要返回能級較低的第一單線態(tài)才能用于光合作用，多余的能量也是以熱的形式耗散。因此，植物進行光合作用時對紅光的能量利用率的高于對藍光的能量利用率。

1.2 葉綠體熒光淬滅現(xiàn)象

在葉綠素熒光誘導過程中，熒光由最高值降至穩(wěn)態(tài)，這種熒光產量的下降稱為葉綠素熒光淬滅。在葉綠體的分離過程中，在2 min內葉綠體的熒光減少到穩(wěn)定態(tài)[6]。在有機溶劑中葉綠素的熒光產量大約為30%，然而在進行光合作用的葉綠體的熒光產量為0.5-3%，這種現(xiàn)象也稱為熒光淬滅。它包括光化學淬滅和非光化學淬滅。光化學淬滅是指葉綠體的電子傳遞鏈處于氧化態(tài)，反應中心開放，會發(fā)生電子傳遞和電荷分離，形成ATP等產生熒光淬滅，反映出PSⅡ天線色素吸收的光能用于光化學電子傳遞的分額和QA的氧化狀態(tài)。非光化學淬滅是指PSⅡ天線色素分子吸收了過量的光能不能用于光合電子傳遞而以熱耗散造成的光能產量降低。有機體為了免于過量光吸收的損害，產生了非光化學淬滅途徑。在一個光合作用驅動的系統(tǒng)中，葉綠體的熒光淬滅提供了一個葉綠素被光激發(fā)與原初轉換反應之間的關系[7]。所以實驗材料要新鮮，用前進行充分光照，以保證葉綠體和葉綠素的活性。

2 質壁分離法制備離體葉綠體的方法

2.1 實驗原理

生活細胞的原生質膜是一種選擇性透過膜。當細胞外的溶液濃度較高（高滲溶液）時，細胞內的水分便向外滲出，引起質壁分離。然后鋒利的刀片將已經發(fā)生質壁分離的葉片切碎，一部分細胞的細胞壁被切去。將葉片放在低滲溶液時原生質體吸水，發(fā)生質壁分離復原，這時原生質體從細胞壁的破口處釋放出來。用等滲溶液(0.35 mol/L NaCl 或者0.4 mol/L蔗糖溶液)處理原生質體，原生質體破裂釋放出葉綠體?？梢杂糜谟^察葉綠體的形態(tài)、結構和熒光現(xiàn)象。

2.2 操作步驟

① 取一片葉,用刀片在背面劃十字(注意：不要劃破葉片)并且挑起下表皮。用鑷子從四個角撕去下表皮。切成0.5 ×0.5 cm2左右的小塊，轉入盛有0.9 mol/L NaCl溶液的注射器中推拉幾次推桿，抽去葉片中的氣體。再轉入盛有0.9 mol/L NaCl溶液的表面皿中浸泡10-20min。② 取3-4小塊葉片放入載波片上滴有幾滴0.9 mol/L NaCl溶液中，用刀片成條狀切碎。③離體葉綠體的分離： 將條狀切塊分批轉移到另外一塊載玻片滴有一滴0.35 mol/L NaCl溶液中，片刻后，用鑷子小心搗動并去掉葉片碎塊。此時，溶液中葉肉原生質體流出、破裂并釋放出葉綠體，蓋上蓋玻片。這時可以觀察葉綠體及其熒光。注意，在載玻片上0.35 mol/L NaCl溶液中多放些葉片碎塊應以溶液淹沒為度。在溶液中分批轉入碎塊是為了收獲更多的葉綠體。在載玻片上滴0.9 mol/L NaCl溶液時不能過多，以覆蓋0.5 × 0.5 cm2的小塊葉片為宜，溶液過多時用吸水紙吸去一部分，以防止溶液外溢。如果想獲得完整的原生質體，可以將②中的條狀碎塊轉移到載玻片上含有一滴0.6 mol/L NaCl溶液中即可。

2.3 本方法的優(yōu)點

一般情況下，制備植物葉綠體的方法是差速離心法。用這種方法分離葉綠體的操作條件要求較高。因為葉綠體活力會隨著離體時間延長而不斷下降，因此，如果在常溫下操作，應該盡可能在短時間內完成。一般要求在0-4℃條件下完成操作步驟，使離體葉綠體活性保存時間長些。但是在實驗過程中一個班( 30 - 40人)同時進行、離心機和熒光顯微鏡通常為多人共用, 難以做到迅速分離和觀察。此外，研磨葉片時不要用力過猛和連續(xù)研磨以及研磨過細，應以不延續(xù)研磨和把葉片研磨成小塊為宜，在沒有進行預實驗的情況下研磨葉片時的力度和研磨次數難以掌握。研磨液需要用4層紗布過濾，濾液要經過逐級離心才能分離出葉綠體，這樣葉綠體在體外的時間較長，增加了葉綠體熒光淬滅和活性喪失的機會。一次實驗要使用較多材料（30 g左右）來提取葉綠體，否則經過研磨、過濾和分級離心以后得到的葉綠體的數量非常少，這樣也減少了每個學生動手操作實驗的機會。

運用質壁分離法制備離體葉綠體，操作簡單，不需要組織搗碎機和離心機等設備。所用的實驗材料少，適合每一位同學動手操作實驗。制備葉綠體的步驟少，所需的時間短，可以有效保存葉綠體的活性，減少葉綠體熒光淬滅的機會，觀察到的葉綠體的熒光現(xiàn)象明顯，實驗結果好。

3 觀察葉綠體熒光現(xiàn)象

3.1 離體葉綠體與細胞內的葉綠體熒光強度比較

將制備好的離體葉綠體裝片和葉肉裝片放在熒光顯微鏡下觀察，可見離體葉綠體的熒光要比細胞內的葉綠體的要亮。這是由于離體葉綠體光合作用的光反應受阻引起的。因為植物光合作用的光反應在葉綠體類囊體薄膜上進行。葉綠素分子吸收光能，被激發(fā)出一個高能電子。這個電子則在類囊體膜上的電子傳遞鏈傳遞下去，并將 H+質子從葉綠體基質泵入到類囊體腔，建立電化學質子梯度，用于 ATP的合成，NADP+接受高能電子被還原為NADPH。葉綠素分子由于失去一個電子，就留下一個空穴，只得從周圍的水分子中奪得電子，因而促使水的分解。由于離體葉綠體基質中ADP+和NADP+和CO2有限，不能從細胞質中得到補充，高能電子的傳遞受阻，其能量重新以熒光形式發(fā)射出來，所以其熒光強度較亮；在同等光照強度的情況下，細胞內的葉綠體的光合作用能夠順利進行，葉綠素分子吸收光照產生的激發(fā)能主要用于光合作用，葉綠素發(fā)射的熒光量子就少，其熒光強度就低[8]。同樣地，離體葉綠素的熒光比細胞內的熒光要強。這是因為離體葉綠素沒有結合在葉綠體中的類囊體上，葉綠素分子受到光能激發(fā)產生的高能電子的能量不能傳遞到電子傳遞鏈重新被發(fā)射出來，所以熒光強度較強；然而細胞中葉綠素分子結合在類囊體上，在同等光照強度的情況下葉綠素分子受到光能激發(fā)產生的高能電子的能量能可以傳遞到電子傳遞鏈進行光化學反應，能夠被發(fā)射出來的熒光量就少，所以熒光強度就弱。

3.2 不同濾光片下葉綠體自發(fā)熒光的比較

在熒光顯微鏡下?lián)Q用不同濾光片觀察葉綠體裝片，可見葉綠體的自發(fā)熒光會發(fā)生變化，葉綠體的顏色相應地發(fā)生改變。這是因為葉綠體的熒光特征基本上是由吸收光的色素、激發(fā)能的轉移和產生熒光色素的特性決定的，也受反應中心和 PSⅡ的電子供體和電子受體的還原狀態(tài)的影響，還受溫度、光照強度、水分等環(huán)境因素的影響。在植物體內由于激發(fā)能從ch1b 向ch1a 的傳遞效率幾乎達到100% , 所以PSⅠ色素系統(tǒng)基本不發(fā)熒光，檢不出體內ch1b 的熒光。在室溫下，細胞內和離體葉綠體的熒光幾乎都是來源于 PSⅡ的Chl a，發(fā)射的熒光產量和動力學是與PSⅡ的原初光化學反應密切相連的[9,10]。植物進行光合作用時，葉綠體分子吸收的光主要是藍光和紅光(400-700 nm, 它被稱為光合作用有效輻射)，然而葉綠體產生的熒光主要在紅光至幾乎紅外光(660-800 nm)區(qū)。葉片中葉綠素產生的熒光有兩個最大值：紅光區(qū)（大約686-690 nm）和遠紅光區(qū)（大約730-740 nm）[11]，所以熒光是葉綠素吸收光能以后重新以光的形式發(fā)射出來的波長較長的光。在介質中沒有添加輔助因子（維生素C、維生素K13，AMP + Mg2++ FMN + TPN）的離體葉綠體的熒光誘導現(xiàn)象比完整葉片里的葉綠體的熒光誘導現(xiàn)象明顯地簡單[12]。

總之，運用質壁分離法制備離體葉綠體和熒光觀察的方法，能夠克服用差速離心法制備葉綠體耗時、葉綠體活性難以保證等缺點；能夠清楚地觀察到離體葉綠體的自發(fā)熒光現(xiàn)象，也為觀察葉綠體的次生熒光現(xiàn)象打下了基礎。在我校生物技術專業(yè)的實驗教學中，運用這一方法，每一組的學生都能動手完成實驗，能夠制備到有活性的離體葉綠體并且清楚地觀察到熒光現(xiàn)象的學生人數達到95%以上。這一方法將會在今后的學生分組實驗教學中得到有效的應用。

[1]Govindjee.Sixty-three years since Kautsky: chlorophyll a fluorescence[J].Aust J Plant Physiol, 1995, 22: 131—160.

[2]彭玲主編.普通生物學實驗[M].武漢:華中科技大學出版社,2009,p65.

[3]Rohácek K, and Barták M.Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic concepts, useful parameters,and some applications[J].Photosynthetica, 1999, 37:339-363.

[4]Maxwell K, Johnson GN.Chlorophyll fluorescence - a practical guide[J].Journal of Experimenral Botany, 2000,51:659-668.

[5]Krause GH and Weis E.Chlorophyll fluorescence and photosynthesis: the basics[J].Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 1991, 42: 319-349.

[6]Thomas JB, Voskuil W, Olsman H, De Boois HM.Fluorescence-induction phenomena in isolated chloroplasts[J].Biochim.Biopkys.Acta, 1962，59: 224-226.

[7]Arnon DI, TsuJimoto HY, and Mcswain BD.Quenching of chloroplast fluorescence by photosynthetic phosphoryla tion and electron transfer[J].Biochemistry, 1965, 54:927-934.

[8]Arnon DI, Tsujimoto HY, and McSwain BD.Quenching of chloroplast fluorescence by photosynthetic phosphorylation and electron transfer[J].PNAS, 1965, 54:927-934.

[9]Homann PH.Cation Effects on the Fluorescence of Isolated Chloroplasts[J].Plant Physiol.1969, 44, 932-936.

[10]Oxborough K.Imaging of chlorophyll a fluorescence:Theoretical and practical aspects of an emerging technique for the monitoring of photosynthetic performance[J].Journal of Experimental Botany, 2004, 55: 1195- 1205.

[11]Buschmann C .Variability and application of the chlorophyll fluorescence emission ratio red/far-red of leaves[J].Photosynthesis Research, 2007,92: 261-271.

[12]Thomas JB, Voskuil W, Olsman H, De Boois HM.Fluorescence-induction phenomena in isolated chloroplasts[J].Biochim.Biopkys.Acta, 1962，59: 224-226.