調節性T細胞在過敏性鼻炎及抗原特異性免疫治療中的作用

婁 瑋 王成碩 張 羅

(首都醫科大學附屬北京同仁醫院耳鼻咽喉頭頸外科北京市耳鼻咽喉科研究所耳鼻咽喉頭頸科學重點實驗室，北京100730)

過敏性鼻炎(allergic rhinitis，AR)其發生機制主要是特應性個體(atopic individual)接觸變應原后發生以IgE介導的鼻黏膜慢性炎性反應，整個反應過程中多種炎性細胞參與其中，包括效應T細胞、自然殺傷T細胞，嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、肥大細胞，靜息的組織細胞和調節性T細胞(regulatory T cells，Treg細胞)等［1-2］。大量研究［3-4］顯示 Treg 細胞作為免疫負調節的角色出現，在免疫耐受中發揮著舉足輕重的作用。動物的實驗研究顯示，過繼性轉移Treg細胞可防治或減輕T細胞介導的疾病，包括變態反應性疾病、哮喘、自身免疫性疾病、移植免疫排斥反應等，它可使機體對變應原、自身抗原、異體抗原形成免疫耐受。因此，誘導機體產生抗原特異性Treg細胞已經變成治療過敏性疾病的一大目標，臨床研究結果表明抗原特異性免疫治療是目前唯一能誘導人體產生抗原特異性Treg細胞的有效手段。而對Treg細胞在過敏性鼻炎發病及抗原特異性免疫治療中的作用研究仍在探索之中。

1 調節性T細胞

廣義而言具有免疫抑制或免疫調節作用的T細胞統稱為調節性T細胞(Treg細胞)，它能防止機體對自身抗原或環境中的無害抗原包括過敏原產生免疫反應，它們限制機體對抗致病原的免疫反應以減少因清除病原體而導致的組織自身免疫損傷。然而，眾所周知NK細胞，NKT細胞，CD8+T細胞，B細胞和肥大細胞等都具有重要的免疫調節作用，但目前學者將焦點放在了CD4+Treg細胞上，主要是由于其能產生且擴增與疾病相關抗原特異性抑制細胞［5-7］。

1.1 調節性T細胞的來源及分類

早在20世紀70年代人們就發現了機體中存在一群具有免疫抑制作用的細胞，但一直苦于沒有明確的細胞表面標記，使研究一直處于停滯狀態。到20世紀90年代，人們對Treg細胞有了進一步的認識。根據來源的不同人們將Treg細胞人為的分成天然Treg細胞(natural regulatory T cells，nTreg細胞，主要為CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞)和誘導Treg細胞(inducible regulatory T cells，iTreg細胞，主要包括 CD4+CD25+Foxp3+Foxp3-Treg細胞，Tr1，Th3 等)，nTreg主要來源于胸腺，其發育時期即作為抑制針對自身抗原反應的T細胞亞群而存在，主要特異性針對自身抗原發揮免疫抑制/調解作用。iTreg細胞是來自胸腺的幼稚T細胞(na?ve T cell)在外周經抗原誘導分化而發育成熟而獲得免疫抑制活性，主要針對外源性的抗原發揮作用。

至于胸腺來源的和外周誘導的Foxp3+Treg細胞在過敏性疾病中的作用孰重孰輕目前仍難以定奪。外周免疫誘導作為一重要機制主要針對外源性的或環境中的抗原(包括變應原)產生特異性的Foxp3+Treg細胞，并且這群細胞隨著年齡的增長會持續存在，這一理論在小鼠的實驗模型中已得到證實，針對過敏性呼吸道疾病的Foxp3+Treg細胞被成功誘導。另外一群具有分泌大量IL-10的Treg細胞被稱作Tr1細胞(或稱IL-10-Treg細胞)，這群細胞被認為在特異性維持氣道免疫環境穩定中發揮重要作用［3］。而分泌TGF-β的Treg細胞(Th3細胞)主要與腸道免疫有關［8］，但同時也會在肺部炎性反應清除病變的同時，促進纖維化與組織重塑等。

1.2 調節性T細胞的標記

長期以來使Treg細胞的研究一直處于爭議之中的關鍵就是缺乏獨特的細胞表面標記來定義這些免疫抑制細胞。學者們最先發現天然Treg細胞和部分誘導Treg細胞表面穩定地表達IL-2受體(IL-2R)的α鏈，即CD25，因此將CD4+CD25+T作為Treg細胞標記，然而CD25可以表達在所有活化的T細胞表面，一直以來以CD4+CD25+T作為Treg細胞標記試圖對過敏性疾病中的Treg細胞功能進行研究，不同的研究組采取各自的方法分離，研究同一細胞，所得出的結論不同甚至是矛盾，使得對該病的認識陷入泥潭之中。此外的細胞標記還包括 CD62L，CTLA-4，GITR等［9］，但多數均證實也被活化的效應T細胞所表達。

后來人們發現，Foxp3，一個叉頭/翼狀螺旋轉錄因子，被報道是CD4+CD25+Treg細胞特有的一個標記物，它表達在大多數的CD4+CD25highT細胞和少部分CD4+CD25intT細胞，且其與CD4+CD25+Treg細胞表型和功能的維系密切相關。將Foxp3轉入幼稚T細胞(na?ve T cell)內可使其產生類似 CD4+CD25+Treg細胞的表型特征［10］，如細胞表面表達 CD25、CTLA-4等抗原，并具備抑制活性。但同時在人類Foxp3的表達可以在活化的效應T細胞被短暫的誘導，可又不具有Treg細胞的功能。且因其是核蛋白，從分離Treg細胞的角度講Foxp3的意義是有限的。然而，盡管如此，人們想盡辦法，展開了大量的Treg細胞在過敏性疾病中的功能性研究，如 CD25+，Foxp3+，CD127-等標記表型劃定了一群有意義的Treg細胞。迄今為止，還沒有發現關于Tr1細胞和Th3細胞特異性的表面標記。

1.3 調節性T細胞的作用機制

關于Treg細胞的作用機制目前仍不十分清楚。Treg細胞可以通過一系列的免疫學機制(包括依賴細胞接觸途徑、競爭細胞生長因子、細胞毒性、分泌抑制因子等)抑制T淋巴細胞、抗原遞呈細胞和幼稚細胞的功能。而多數的研究［4，10］表明通過分泌細胞抑制因子如IL-10，TGF-β是其發揮作用的主要方式。

多數的研究者都一致認為盡管不同種類的Treg細胞均具有抗原特異性，但卻以非抗原特異性的途徑發揮著免疫抑制作用。像目前比較清楚的有Th3細胞通過分泌TGF-β、Tr1細胞通過分泌IL-10發揮免疫抑制作用。相比較而言，多數報道指出CD4+CD25highFoxp3+Treg細胞在人和小鼠中主要是依賴細胞接觸機制發揮作用。但是Treg細胞表面分子及其在免疫抑制過程中的作用途徑目前還不十分清楚。

而無論是人或鼠，CD4+CD25+Treg細胞都是通過細胞連接依賴性機制發揮作用的。但參與該細胞連接介導的抑制機制的表面分子和信號途徑尚未能明確。其細胞膜表面的CTLA-4和可溶性TGF-β提供免疫抑制信號已被證實［11］。在小鼠和人的實驗研究中有報道［12］，CTLA-4和可溶性 TGF-β 的聯合作用可阻斷靶細胞CD4+或CD8+CD25-T細胞增生和功能實現。通過對胸腺的 CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞抑制機制研究［13］表明Th2細胞較Th1細胞對CTLA-4/mTGF-β介導的免疫抑制機制更為敏感。可是在后來的報道中有研究［14］顯示依賴CTLA-4/mTGF-β介導的免疫抑制途徑的機制遭到質疑，因為在缺乏TGF-β1的情況下CD4+CD25+Treg細胞的免疫抑制作用依舊存在。值得注意的是，有研究［15］表明TGF-β在Treg細胞抑制活性和Foxp3的表達和(或)維持上發揮不可或缺的作用。在人體，經過TGF-β治療后自然和誘導CD4+CD25+Treg細胞能對CD4+CD25-T細胞更好的發揮免疫抑制作用，而在小鼠實驗中卻未能得到同樣的驗證。CTLA-4在CD4+CD25+Treg細胞抑制活性中的作用主要表現在上調同一細胞表面的TGF-β的表達。相反，CD4+CD25+Treg細胞表面的另一類分子GITR在TGF-β的存在下，在抗-GITR抗體或刺激GITR配體作用下削弱CD4+CD25+Treg細胞的抑制作用，起到了負調節的作用［16］。

2 調節性T細胞在過敏性鼻炎發病機制中的作用

特應性個體在遇到過敏原后不能正常地建立起免疫耐受狀態，繼而發生過敏性炎性反應。整個的免疫反應過程，可被分為炎性細胞活化、靶器官遷徙、存活、激活及免疫細胞的效應反應［17］。過敏性炎性反應發生的初始階段主要是抗原特異性CD4+T細胞的產生，T細胞可以被吸入過敏原活化，它們在鼻相關的趨化因子網的作用下發生器官選擇性遷徙，從而炎性反應細胞在局部組織存活發生炎性反應［18］，在IL-4的作用和持續的抗原刺激下，未分化T細胞被抗原遞呈細胞活化，向Th2細胞分化。而抗原特異性Th2細胞的活化導致大量Th2細胞因子的產生，包括IL-4、IL-5、IL-9和IL-13等，從而介導重要的免疫調節和效應作用。這些因子誘導B細胞產生抗原特異性IgE(大部分的IgE產生是在淋巴組織和骨髓完成，在局部組織如鼻黏膜也可觀察到局部IgE的產生)，炎性反應的發展及嗜酸性粒細胞向局部組織遷徙，黏液產生［19］。IgE介導的嗜中性粒細胞和肥大細胞脫顆粒導致了I型變態反應炎癥的發生。而Th1細胞促成了過敏性炎性反應的形成及效應階段，特別是在活化和促進靜息的組織細胞凋亡［20］。

過敏性炎性反應中，T細胞作為一個重要的細胞亞群在局部組織中大量浸潤，產生免疫失調反應，而這種“失控”狀態促使了過敏性炎性反應的持續存在。然而在正常個體和成功免疫治療的個體中，Treg細胞通過分泌IL-10、TGF-β等細胞因子或細胞-細胞接觸機制參與到了整個抗原特異性外周免疫耐受的調控過程，如抑制抗原特異性IgE產生、誘導非炎性抗體IgG4等的產生，抑制肥大細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞的過敏性炎性反應。更重要的是Treg細胞抑制Th2細胞的細胞因子的釋放，如IL-4，IL-5，IL-9和IL-13等，從而間接抑制了細胞的分化、局部存活、部分細胞的活化(如肥大細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞等)及Th2細胞歸巢等。此外抑制Th0/Th1細胞誘導轉化，從而減少局部組織的損傷。

既然Treg細胞在外周免疫耐受中發揮重要的調節作用，那么其在過敏性炎性反應的發病中的作用如何呢?有研究［21］顯示，在特應性個體中，抗原調節性Treg細胞數量和(或)功能存在缺陷。部分研究［22］表明，過敏性兒童的Treg細胞在過敏季節數量增加。部分研究［23］中外周抗原特異性 CD4+CD25highFoxp3+Treg細胞在特應性個體和健康個體中未發現顯著差異。但卻有研究［24］證實Foxp3的表達與IgE，嗜酸性粒細胞，IFN-γ的水平呈負相關，FOXP3+/CD4+的比率在過敏性個體中顯著降低。通過細胞因子譜化分T細胞亞群，分別以分泌 IFN-γ，IL-4，IL-10的抗原特異性CD4+T細胞代表Th1，Th2和Tr1細胞，研究顯示，雖然在健康個體和變應性個體中這3種細胞亞群均存在，但是比例有所不同。研究［21］表明在健康個體中主要表現為可探測的以抗原特異性的IgG反映為主，Tr1細胞作為主要細胞亞群針對環境中的一般抗原反應。在過敏性個體中是以分泌IL-4的Th2細胞反應為主。因此效應Th2細胞或Tr1細胞在外周所占的比重決定了機體免疫狀態。

3 調節性T細胞在抗原特異性免疫治療中的作用

目前，過敏性鼻炎癥狀可通過抗組胺藥物、抗白三烯藥物、糖皮質激素藥物等得以緩解，但這只是暫時的抑制IgE介導的過敏性反應(如過敏性鼻炎、過敏性結膜炎等)。而抗原特異性免疫治療對過敏性疾病的治療遠期療效卻是顯著的，它不僅可抑制過敏反應的發生，還可有效改善過敏癥狀，并可以防止其對新的過敏原產生過敏反應［25］，降低過敏性鼻炎患者發展成為哮喘的概率［26］。盡管其在臨床中的應用已近一個世紀，然而其作用機制仍在探索之中［27］。

3.1 SIT調節Th2-Th1反應平衡

一直以來人們認為，過敏性炎性反應是由Th1-Th2細胞反應失衡所導致，因而大量學者將免疫治療機制研究放在了Th1-Th2細胞的免疫反應平衡中，研究顯示成功的抗原特異性免疫治療的確可以使免疫反應從以Th2細胞反應為主向Th1細胞反應方向偏移［28-29］，而隨著研究的不斷深入及認識的不斷加深，發現這一理解未免有些片面，在過敏性炎性反應的發生的整個過程中均需要外周T細胞的活化，因此T細胞的免疫耐受可減少或終止以上反應的發生。

3.2 SIT誘導外周Treg細胞形成免疫耐受

外周抗原特異性免疫耐受的誘導是抗原特異性免疫治療的關鍵。外周T細胞的免疫耐受主要是誘導產生抗原特異性Treg細胞，從而抑制效應細胞的活化及增生，主要表現為在其遇到抗原后顯示為“無能”，從而克服變態反應中的速發象和遲發象反應。外周抗原特異性免疫耐受涉及多個抑制因子，如IL-10、TGF-β、細胞毒性T淋巴細胞抗原-4(CTLA-4)等。因此，抗原特異性外周T細胞免疫抑制通過IL-10、TGF-β等細胞因子(主要是由Tr1細胞自分泌產生)介導發揮作用。臨床研究表明，在經過抗原特異性免疫治療的個體上調了CD4+CD25+Treg細胞的抑制細胞增生作用，在經過花粉免疫治療之后增加了外周血和黏膜組織中的 IL-10［30］和 TGF-β［31］的表達。對蜂毒過敏的研究可作為抗原特異性免疫治療機制研究的經典模型，經歷多次蜂蟲叮咬之后，蜂毒抗原特異性Th1和Th2細胞克隆增生，同時向分泌IL-10的Tr1細胞反應轉化，結果減少了T細胞介導的皮下遲發反應的發生，抑制抗原特異性T細胞的增生和Th1和Th2細胞因子的分泌。除此之外，抗原特異性免疫治療能有效的調節肥大細胞、嗜堿性粒細胞活化閾值減少IgE介導的組胺釋放［32］。此外，IL-10減少肥大細胞致炎因子的釋放，還下調嗜酸性細胞的功能、活化，抑制IL-5的產生。另外，還發現肥大細胞和嗜酸性粒細胞數量的減少 ，包括相應介質釋放的減少［33］，然而這些免疫學的改變往往伴隨著外周血中調節性T細胞數量(CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞，Tr1細胞)的增加和(或)功能的提高，這些可以說是誘導T細胞免疫耐受的結果。

3.3 SIT誘導Treg對血清抗體的調節

哪些Treg細胞能調節B細胞作用而調節血清抗體的產生是問題的關鍵。對小鼠的研究［34］顯示，CD4+CD25+CD69-Treg細胞可轉移到生發中心，以負性調節B依賴T細胞的抗體產生。盡管通過免疫治療的外周T細胞的免疫耐受形成得到證實，而特異性免疫治療期間B細胞產生抗原特異性IgE，IgG4抗體的能力沒被抑制［35］。研究證實健康個體中針對塵螨抗原血清中的抗體主要是特異性IgA和IgG4，伴隨少量的IgG1反應和極其少量的IgE。在免疫治療的早期血清中抗原特異性IgE、IgG4抗體的水平升高，其中IgG4抗體升高的尤為顯著，IgE/IgG4比率的降低可達到10～100倍。IL-10對總的和抗原特異性IgE具有潛在的抑制作用，而同時可刺激抗原特異性IgG4的產生。對治療初期的研究［36］證實，70 d的屋塵螨抗原特異性免疫治療沒有顯著降低抗原特異性IgE水平，然而卻顯著增加了大量的 IgA，IgG1和IgG4［36］，這些抗體的增加同時伴隨著血清中IL-10和TGF-β的增加。這些研究表明抗原特異性免疫治療中，Treg細胞除了有抑制效應細胞的增生及反應的能力，同時還調節血清中的抗體水平。

3.4 SIT誘導局部組織Treg表達

研究表明抗原特異性免疫治療的確使外周血中免疫狀態發生改變，那么在外周局部組織的反應是否也是如此呢?有學者觀察經過花粉特異性免疫治療后鼻黏膜的T細胞反應，研究顯示經過治療后增加了T細胞的IL-10 mRNA的表達，然而，與在外周血中觀察的結果不同的是抗原的暴露并未增加非特應性個體的局部組織中IL-10的表達。經過抗原特異性免疫治療之后，局部鼻黏膜組織中的Th1細胞的活化及CD4+CD25+T細胞在局部黏膜的增加得到證實［37-38］，不能完全反映外周的免疫耐受狀態，主要與反應的不同階段有關，如細胞凋亡，細胞轉移，細胞歸巢，存活信號，這些都和抗原暴露及環境因素有關。

4 展望

近年來人們對Treg的認識不斷深入，關于Treg細胞與過敏性疾病的關系的研究已經引起了變態反應學界的高度重視。Treg細胞在維持自身內環境穩定和免疫耐受的形成過程中具有不可替代的作用。而Treg細胞的形成或功能的缺陷與過敏性鼻炎有著密切關系，對于其功能調控機制的研究也就自然成為了呼吸道變應性疾病研究的一個重要靶點。盡管在過去的十幾年間學者作出了巨大努力，但有關這些細胞從識別、分離，到作用機制和免疫生物學特性的研究，乃至到進一步的治療策略的臨床開發與應用都存在未知。但我們堅信只要堅持不懈地走下去相信一定會在基礎和臨床研究方面取得重大進展，造福于病患。

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