術(shù)中應(yīng)用OSNA技術(shù)檢測乳腺癌前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的臨床意義

劉娟娟，孫 曉，李太玉，王永勝，宋現(xiàn)讓，仲偉霞，周長春，穆殿斌，周正波，李永清

(山東省腫瘤防治研究院，濟(jì)南250117)

乳腺癌前哨淋巴結(jié)活檢術(shù)(SLNB)已經(jīng)替代腋淋巴結(jié)清除術(shù)(ALND)成為臨床腋淋巴結(jié)陰性的早期乳腺癌患者的標(biāo)準(zhǔn)處理術(shù)式［1，2］，前哨淋巴結(jié)(SLN)的診斷技術(shù)是SLNB的關(guān)鍵技術(shù)之一。2010年2～6月，我們應(yīng)用一步核酸擴(kuò)增(OSNA)對113例乳腺癌患者的SLN進(jìn)行檢測，對照術(shù)后常規(guī)病理檢測結(jié)果，評估OSNA檢測在SLN術(shù)中的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本文共入選113例乳腺癌患者，均為女性，年齡29～82歲，中位年齡47歲。術(shù)前均病理診斷明確，符合SLNB適應(yīng)證并自愿接受SLNB。其中，浸潤性導(dǎo)管癌69例，浸潤性小葉癌13例，導(dǎo)管內(nèi)癌7例，其他類型28例。按照山東省腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的研究方案和赫爾辛基宣言，每例入選患者均在知情同意書上簽字。先前曾接受過新輔助化療和同側(cè)腋窩手術(shù)的患者，本項(xiàng)研究不予納入。

1.2 方法

1.2.1 SLN處理 按SLN的質(zhì)量及短軸長度進(jìn)行切分，若SLN質(zhì)量小于100 mg，則不進(jìn)行切分;SLN術(shù)中同時(shí)行快速冰凍病理(FS)檢測，術(shù)后行常規(guī)病理檢測。SLN質(zhì)量100～1 200 mg，則進(jìn)行切分。若SLN短軸長度小于4 mm，則切分為2枚組織塊，術(shù)中均行印片細(xì)胞學(xué)(TIC)檢測后，1枚組織塊行OSNA檢測，另1枚行FS檢測，術(shù)后FS檢測組織塊剩余組織行常規(guī)病理檢測;若短軸長度在4 mm以上，則切分為4枚組織塊，術(shù)中均行TIC檢測后，奇數(shù)組織塊行OSNA檢測，偶數(shù)組織塊行FS檢測，術(shù)后FS檢測組織塊剩余組織行常規(guī)病理檢測。術(shù)中FS、TIC、OSNA檢測任一陽性者，即轉(zhuǎn)行ALND。

1.2.2 OSNA檢測 OSNA檢測基于逆轉(zhuǎn)錄—環(huán)狀介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增原理，通過對SLN中CK-19的測定，快速檢測大于0.2 mm的轉(zhuǎn)移灶。檢測的操作人員均參加一項(xiàng)為期2 d的培訓(xùn)，在對患者的淋巴結(jié)樣品進(jìn)行檢測前，已使用Sysmex公司提供的樣本通過了熟練操作測試。先用LYNOAMP BC試劑創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，后將SLN組織塊進(jìn)行勻漿，隨后將引物、CK-19、酶、CK-19陰性及陽性質(zhì)控、淋巴結(jié)原倍及稀釋樣本放入RD-100i OSNA Assay進(jìn)行擴(kuò)增。OSNA檢測的(++)、(+)及出現(xiàn)反應(yīng)抑制結(jié)果被判定為SLN陽性。

1.2.3 常規(guī)病理檢測 該診斷作為SLN診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，切片厚度為4～6μm，每個(gè)SLN組織塊取4張切片。本研究中，SLN中大于0.2 mm的轉(zhuǎn)移灶定義為SLN陽性，僅有孤立腫瘤細(xì)胞團(tuán)(ITC)者定義為淋巴結(jié)陰性。采用的診斷標(biāo)準(zhǔn)為2002年第6版美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)腫瘤分期，＞2 mm的轉(zhuǎn)移灶定義為宏轉(zhuǎn)移，0.2～2 mm的轉(zhuǎn)移灶定義為微轉(zhuǎn)移，＜0.2 mm的轉(zhuǎn)移灶定義為ITC。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，不同檢測方法之間診斷效率差異采用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

113例患者中，37例常規(guī)病理檢測陽性，43例OSNA檢測陽性。11例OSNA檢測假陽性病例，5例假陰性病例。OSNA的準(zhǔn)確性為85.8%(97/113)，其敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為 86.5%(32/37)、85.5%(65/76)、74.4%(32/43)、92.9%(65/70)。

FS的準(zhǔn)確性為95.6%(108/113)，其敏感性、特異性分別為86.5%(32/37)、100%(76/76);TIC的準(zhǔn)確性為92.0%(104/113)，其敏感性、特異性分別為 91.9%(34/37)、92.1%(70/76)。OSNA 的敏感性與 FS(P=1.00)及 TIC(P=0.454)相似。

對于SLN宏轉(zhuǎn)移患者，OSNA的敏感性則為90.6%(29/32)，F(xiàn)S和 TIC 的敏感性分別為 90.6%(29/32)和 96.9%(31/32)，三者表現(xiàn)相似(P=0.161)。對于SLN微轉(zhuǎn)移患者，OSNA和TIC的敏感性均為60.0%，顯著高于 FS(0)(P=0.038)。

3 討論

SLN的術(shù)中診斷可使SLN陽性患者通過一次手術(shù)完成ALND，避免二次手術(shù)，降低了二次手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)和費(fèi)用。當(dāng)前，SLNB已成為除炎性乳腺癌以外的臨床腋淋巴結(jié)陰性的浸潤性乳腺癌患者的標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)方式［3］，其適應(yīng)證的擴(kuò)大對術(shù)中診斷提出了更高的要求。目前國際上和國內(nèi)普遍使用FS和TIC作為術(shù)中診斷的檢測方法［4］。FS和TIC的主觀性較強(qiáng)，當(dāng)存在微轉(zhuǎn)移時(shí)容易漏診。van de Vrande等［5］報(bào)道，F(xiàn)S對大體轉(zhuǎn)移和微轉(zhuǎn)移的敏感性分別為84%和61.1%。薈萃分析顯示，TIC對二者的敏感性分別為81%和22%［6］。本研究FS和TIC的敏感性分別為86.5%和91.9%，二者對微轉(zhuǎn)移的敏感性分別為0和60.0%。相對于傳統(tǒng)的將SLN切分為二進(jìn)行檢測的方法，本研究采用的方法顯著提高了FS和TIC的敏感性，這是本研究FS及TIC的敏感性高于文獻(xiàn)報(bào)道水平的重要原因。

CK-19是上皮細(xì)胞的標(biāo)志基因，可作為乳腺癌在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物，OSNA檢測基于逆轉(zhuǎn)錄環(huán)狀介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增原理，快速檢測淋巴結(jié)中CK-19的表達(dá)，該技術(shù)具有無需mRNA純化、應(yīng)用6個(gè)引物提高特異性的優(yōu)勢。Tsujimoto等［7］的研究首先顯示，OSNA檢測 SLN的準(zhǔn)確性為96.4%，CK-19是OSNA檢測的最佳基因，可根據(jù)其閾值進(jìn)行半定量檢測。Visser等［8］的研究顯示，OSNA檢測的準(zhǔn)確性、敏感性和特異性分別為 96.8%、94.7%、97.1%。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相似。

目前，多個(gè)指南均推薦將SLN切分為2 mm左右厚度的組織塊后進(jìn)行連續(xù)切片或逐層切片。美國腫瘤學(xué)會(huì)推薦對每個(gè)2 mm厚的組織塊在第1層面基礎(chǔ)上間隔 200～500μm 再切1～2個(gè)層面［9］。90%的歐洲研究機(jī)構(gòu)對SLN進(jìn)行連續(xù)切片［10］。連續(xù)切片只能評估約5%的SLN組織。受國情影響，大部分國內(nèi)醫(yī)院對SLN僅行單個(gè)層面HE染色切片，容易漏診微轉(zhuǎn)移灶，具有更高的假陰性率。相比之下，OSNA可對100%的SLN組織進(jìn)行檢測，克服了常規(guī)病理檢測方法存在取樣誤差的不足。同時(shí)，OSNA檢測易于掌握，避免了主觀因素的干擾。

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